稗草内生菌降解草甘膦菌株的筛选及降解特性

曾晓宇，刘 琛，娄晓梦，吕雅婷

（湖南交通工程学院，湖南衡阳 421000）

在我国，除草效率最高、使用最广泛的除草剂是草甘膦，草甘膦的使用保证了农产品的高产丰收［1］。过量的草甘膦会对环境和人类健康产生一定的威胁［2-5］。环境中的草甘膦主要通过3 种方式降解，生物降解、光化学降解和水解［6］，其中生物降解是草甘膦降解的主要方式［7］。

水稻是我国主要的粮食作物，稗草是稻田中数量最多的杂草，严重影响了水稻的正常生长。农民为了提高水稻的产量，使用了大量的除草剂，随之而来的问题是杂草的抗药性增强。植物内生菌具有促进宿主植物生长发育、提高作物抗非生物胁迫能力及防治病虫害等作用。对稗草内生菌进行分离和提纯，测定稗草内生菌对草甘膦的降解率，了解内生菌对稗草抗草甘膦的影响，以期为解决稗草防治这个难题提供些许参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

稗草种子：2020 年5 月于湖南省岳阳市郊区采集，稗草种子采集时应采集成熟且比较饱满的种子，晾干后储存，用信封装好，备用。

供试试剂：马铃薯葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、无机盐培养基、75%酒精、2.5%草甘膦可分散油悬浮剂、色谱乙腈、94%草甘膦原药、次氯酸钠。

1.2 试验方法

1.2.1 稗草的种植

将采集备用的稗草种子用清水浸泡24 h，取出后置于30 ℃恒温箱中培养，待其发芽、盆栽。将稗草幼苗置于恒温箱中培养，定时浇水，当稗草生长到2 叶期时，挑选长势一致的稗草。

1.2.2 内生菌的分离、纯化

取稗草的茎、叶擦干，将其放置于干燥的滤纸上风干。用75%消毒酒精浸泡3 min，用无菌水冲洗3 次。然后用2.5%次氯酸钠（NaClO）溶液漂洗2 min，用无菌水冲洗5 次。再用75%消毒酒精浸泡30 s，用无菌水冲洗3 次。将稗草的茎、叶进行充分的研磨，取适量的稗草汁液稀释成不同的浓度，取适量的稀释液分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和无机盐培养基上，并置于适合的温度下进行培养。用移液枪吸取200 µL 无菌水清洗液，分别置于上述不同培养基上作对照处理；5 d 之后观察菌落长势，待长出菌落后转至新的培养基上进一步培养，分离得到纯化的菌株，然后置于斜面培养基，在4 ℃环境下保存并做好标签。

1.2.3 内生菌的鉴定

从保存好的稗草内生菌中取出少量菌丝，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在26 ℃恒温环境中培养5 d，挑取少量菌丝置于含有一滴乳酸苯酚棉兰染色液的载玻片上，进行棉兰乳酚油制片，最后在AMG EVOS 显微镜下观察、拍照。同时，用Omega 真菌DNA 提取试剂盒提取稗草内生菌的总DNA。将模板设置为内生菌的基因组DNA，利用内生真菌rDNAITS 基因的通用引物ITS 进行PCR 扩增，同时对PCR扩增产物测序。

1.2.4 内生菌对草甘膦的降解

将无机盐液体培养基制作成浓度分别为200 mg·L-1、400 mg·L-1、600 mg·L-1、800 mg·L-1、1 000 mg·L-1、1 200 mg·L-1、1 400 mg·L-1、1 600 mg·L-1、1 800 mg·L-1的草甘膦悬液，加入适量的稗草内生菌，30 ℃恒温摇床中振动48 h，离心后取上清液，将紫外分光光度计的波长调节至243 nm，测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 稗草内生菌形态鉴定及序列分析

稗草内生菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养6 d后的形态特征如图1 所示，菌丝为灰绿色，菌丝末端多处联合。稗草内生菌ITS 扩增产物的琼脂凝胶电泳图如图2 所示，由图2 可知，扩增产物是单一条带，大小约600 bp。把扩增得到的条带在Gene Bank 数据库进行BLAST 比对，稗草内生菌的ITS 序列与青霉属中的Talaromyces funiculosus（KC254067.1）同源性为99%。

图1 内生菌在培养基的菌丝体特征

图2 稗草内生菌ITS 扩增电泳图

2.2 稗草内生菌的生长

稗草内生菌的生长曲线如图3 所示，稗草内生菌的生长速度呈现出先缓慢生长，再呈对数生长，最后逐渐减慢的趋势。从曲线中可知，在0～2 h 稗草内生菌生长缓慢，这是由于内生菌在适应液体培养基的环境；在2～14 h 稗草内生菌生长迅速，呈现出对数生长期，这一时期的稗草内生菌快速繁殖；在14 h 之后的时间里，稗草内生菌逐渐进入衰亡期，这是因为随着稗草内生菌的生长繁殖，培养基内的有害物质逐渐增多，另外培养液中的营养物质逐渐减少，不能持续为稗草内生菌的生长提供营养。

图3 稗草内生菌生长曲线

2.3 稗草内生菌耐草甘膦的活性

国内外学者对草甘膦降解菌的分离、筛选较多，大多集中于环境中存在的菌株，但是有关内生菌对草甘膦的降解作用还鲜有报道。稗草内生菌耐草甘膦的活性如图4 所示，当草甘膦浓度在0～1 200 mg·L-1时，OD 值和草甘膦浓度呈现正相关关系，说明其活性逐渐增强；当草甘膦浓度增大到1 200 mg·L-1时，OD 值最大，说明此时稗草内生菌的活性最大；当草甘膦浓度＞1 200 mg·L-1之后，OD 值逐渐减小，这说明稗草内生菌活性逐渐下降。

图4 稗草内生菌耐草甘膦活性

3 讨论与结论

3.1 讨论

稗草外形与水稻极为相似，与水稻争夺稻田中的养分，且分布广泛，为害严重，已成为农民的“眼中钉”，稻田的“肉中刺”。自然界中存在数量极其庞大的内生菌，可与植物形成寄生、共生和腐生的关系，并长期存活于植物体内。内生菌具有促进宿主植物生长发育、提高作物抗非生物胁迫能力及防治病虫害等作用。因此，研究稗草内生菌的生长特征对于植物的生长发育具有非常重要的意义。

草甘膦是有机磷农药，随着草甘膦的长期单一使用，杂草的抗药性逐渐产生，并严重影响稻田生态环境，危害农业生产。FAN 等第一次分离出能够对草甘膦起到降解作用的蜡样芽孢杆菌，并且蜡样芽孢杆菌可以在草甘膦环境中生长，使其作为唯一的碳源。全鑫等分离出节杆菌属QB-7，它能够以草甘膦为唯一碳源，对草甘膦的降解效率可达99.34%。环境中草甘膦的浓度对巨大芽孢杆菌降解草甘膦的特性有一定的作用。在一定范围内，随着草甘膦浓度的增加，降解作用越好，降解效率也越大。当草甘膦浓度达到500 mmol·L-1时，菌株可以得到很多的营养而迅速生长，导致降解率也不断的增加，表现出最好的降解性能。有研究表明，当草甘膦浓度增加到一定的浓度后，会因为草甘膦本身的毒性，对降解菌起到一定的毒害作用，从而明显抑制菌株的生长，导致降解率的下降。因此，当草甘膦的浓度＞1 200 mg·L-1时，内生菌对草甘膦的耐受性逐渐降低。贺望兴等分离出能够降解草甘膦的为球菌属CGL-1 菌株，对草甘膦的最高耐受浓度为1 200 mg·L-1，此结果正与本研究的结果类似。

3.2 结论

1）稗草内生菌属于青霉属中的Talaromycesfuniculosus。2）稗草内生菌能在以草甘膦为唯一碳源的培养基中正常生长，其对草甘膦的最高耐受浓度为1 200 mg·L-1，能够对草甘膦起到很好的降解作用。