肝癌中铁死亡的调控因素及潜在应用进展

潘亚芳， 郭 玮,2*

1. 复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032 2. 复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，厦门 361015

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝癌类型，是全球第二大癌症死亡原因[1]。当前的HCC治疗方法包括手术切除、局部消融、化学栓塞、肝移植和分子靶向治疗[2]。只有少数肝癌患者在早期被发现，大多数患者则是在中晚期被诊断，而此时他们已失去手术治疗的机会，这也是HCC患者死亡率高的重要原因。对于这些患者，他们迫切需要更有效的治疗途径。在癌细胞中诱导细胞毒性是癌症治疗的主要方法之一，但大多数研究都集中在细胞凋亡领域[3]。由于抗凋亡机制常使癌细胞对抗癌药物产生耐药性，因此诱导新形式的调节性细胞死亡(如铁死亡)，对于开发新的治疗实体肿瘤的方法具有很大的价值。

1 铁死亡简介

铁死亡是在2012年被发现的一种调节性细胞死亡(regulatory cell death，RCD)[4]。在线粒体涉及铁的氧化磷酸化过程中，细胞会产生活性氧类(ROS)，超过细胞抗氧化能力的ROS水平会导致氧化应激反应，从而直接或间接破坏蛋白质、核酸和脂质等大分子物质，导致细胞损伤或死亡[5]，即铁死亡。

铁死亡的主要过程：(1)细胞膜上的多不饱和脂肪酸(PL-PUFA-OH)可被脂氧合酶和ROS氧化，形成脂质过氧化物(PL-PUFA-OOH)；(2)在铁离子存在下，PL-PUFA-OOH会转化为有毒的脂质自由基，导致细胞膜脂质中多不饱和脂肪酸分解；(3)细胞最终会由于细胞膜破裂而死亡。不同于细胞凋亡和坏死，其形态学特征是细胞体积收缩、线粒体膜密度增加、嵴甚至消失，而没有典型的凋亡、坏死和自噬表现[6](表1)。已发现铁死亡存在于许多生理和病理疾病中，如神经退行性疾病[7]、缺血再灌注损伤[8]和一系列癌症[9-11]。铁死亡在肝癌的发生中起着重要作用[12]。铁死亡可通过调节谷胱甘肽(glutathione，GSH)[13]、细胞内脂质过氧化物[14]及其他相关物质的水平影响肝癌的发生发展。铁死亡可作为肝癌的诊断、预防和治疗的靶标，已成为肝癌治疗的研究热点。

表1 调节性细胞死亡类型及其相关特征

2 参与肝癌铁死亡的调控因子

最近在癌细胞中发现了几种铁死亡的调控因子。例如，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4 ，GPX4)是哺乳动物中硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶的一个独特成员，在抑制铁死亡过程中，脂质活性氧的产生起着关键作用[15]。热休克蛋白β-1(heat shock protein beta-1，HSPB1)，分子伴侣的成员，可调节肌动蛋白丝的动力学并减少铁的吸收，从而促进铁死亡[16]。p53则被发现，通过抑制SLC7A11的表达而成为铁死亡的正向调节因子[17]。已知肝癌的发生和发展受多种细胞组分和细胞内信号通路的调节，而有关铁死亡在肝癌中的详细信号转导途径和关键转录调节因子尚在研究当中。铁死亡在癌症尤其是肝癌的治疗中已展现出巨大的前景。

2.1 P62-Keap1-NRF2通路的激活抑制肝癌细胞中铁死亡的发生 核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor，NRF2)是抗氧化反应的关键调节因子。在不受压力的条件下，低水平的NRF2主要是由Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)介导的蛋白酶体降解来维持平衡。受癌症的类型和阶段影响，NRF2在癌症的预防或治疗中起着双重作用。例如，NRF2会阻止化学致癌物或癌基因介导的致癌过程的发生；但若已经癌变，NRF2反而会加速癌变进展。NRF2的过度表达会抑制细胞凋亡，并在几种癌症中促进化学耐药性。研究[18]证明，p62-Keap1-NRF2通路通过上调参与铁和ROS代谢的多个基因[醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶1(HO1)和铁蛋白重链1(FTH1)]，在保护肝癌细胞免受铁死亡中起着中心作用。

当暴露于诱导铁死亡的化合物(如erastin、索拉非尼和丁硫氨酸亚砜亚胺)中时，p62的表达阻止NRF2降解，增强随后的NRF2核积累。此外，核NRF2与转录辅激活因子小v-maf禽肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源蛋白(maf)相互作用，然后激活NQO1、HO1和FTH1的转录。因为NQO1、HO1和FTH1的敲除抑制了铁死亡诱导后肝癌细胞的生长，这些NRF2的靶基因是铁死亡的负调控基因。敲减肝癌细胞中p62、NQO1、HO1和FTH1，促进了erastin和索拉菲尼诱导的铁死亡。同时基因或药物对肝癌细胞NRF2表达/活性的抑制增强了体外和异种移植瘤模型中erastin和索拉菲尼的抗癌活性。这些均证实NRF2的状态是决定肝癌细胞对铁死亡靶向治疗反应的关键因素之一。P62-Keap1-NRF2通路在铁死亡中的功能特征可能为肝癌的治疗提供新的思路。

2.2 Sigma-1受体(Sigma-1 receptor，S1R)对HCC细胞铁死亡的保护作用 S1R是非阿片类受体蛋白。除了中枢神经系统外，S1R还存在于肝、胰腺和癌细胞中[19]。最近的研究报道显示，S1R可能通过激活抗氧化反应元件并减少氧化的GSH和谷氨酸来抑制许多器官中ROS的产生。先前的研究表明，S1R通过调节NRF2-Keap1途径和半胱氨酸/谷氨酸反向交换Xc-系统来调节ROS，这两者均对铁死亡至关重要。研究[20]证实，抑制S1R会调节GPX4、铁代谢和ROS积累，可显著阻断erastin和索拉菲尼诱导的FTH1和TFR1的增加，表明S1R负性调节铁代谢来阻止ROS的积累，且发现S1R的抑制增强了索拉非尼在体外和体内对HCC细胞的抗癌作用。除了引起活性氧的积累，肝脏中的铁超载也是一种调节免疫系统的致癌因子。因此，铁也可能在肝癌发生和癌细胞死亡中扮演双重角色。

2.3 MicroRNA-214-3p靶向肝癌细胞中的ATF4增强erastin诱导的铁死亡 MicroRNA长18～24个核苷酸且为内源性非编码RNA分子，通过使信使RNA(mRNA)不稳定和/或抑制翻译来调节基因表达[21]。MiR-214靶向多种基因(包括Catenin β1、肝癌衍生生长因子和Twist)在人类肝癌中发挥抗肿瘤作用。ATF4是内质网应激的重要因素，且被证明是铁死亡的负调节因子，因此，ATF4的敲除可能使癌细胞易受铁死亡的影响。miR-214-3p是ATF4的上游调节因素[22]。有研究人员[23]在2种肝癌细胞系中研究了miR-214对铁死亡的作用。在体外，他们用erastin(铁死亡诱导剂)处理稳定过表达miR-214可的HepG2和Hep3B细胞，发现miR-214增强erastin诱导的肝癌细胞脂质氧化作用，促进铁死亡的发生且抑制ATF4的表达；在体内，他们对患有Hep3B异种移植肿瘤的裸鼠给予erastin，发现miR-214降低了肿瘤的生长，并降低了用erastin处理的裸鼠体内ATF4的表达。他们证实miR-214在肝癌细胞中促进铁死亡的作用至少归因于其对ATF4的抑制作用。

2.4 LncRNA-GABPB1-AS1和GABPB1在erastin诱导HepG2细胞铁死亡过程中调节氧化应激 很少有研究探讨长链非编码RNAs(lncRNAs)在细胞氧化应激调节中的作用，特别是在铁死亡中。铁死亡对铁的依赖性提示过氧化物酶失活可能是铁死亡的一个重要事件。过氧化物酶在铁离子存在下可阻止过氧化氢产生羟基自由基，进而阻止ROS的积累。已知NRF2具有3个亚基(α、β和γ)，而GABPB1是NRF2的激活亚基。GABPB1与α亚基形成四聚体复合物，并刺激包括抗氧化剂基因过氧化物酶-5(PRDX5)在内的各种基因的转录。LncRNA GABPB1-AS1 是GABPB1 mRNA的反义RNA。研究[24]证明，erastin上调了lncRNA GABPB1-AS1，后者通过阻断GABPB1翻译下调了GABPB1蛋白水平，导致PRDX5基因下调，并最终抑制了细胞抗氧化能力，导致ROS和MDA的积累及HepG2细胞死亡。研究还发现，高表达水平的GABPB1与HCC患者的预后不良相关，而肝癌患者中高水平的GABPB1-AS1与总体生存期提高相关。这些发现揭示了GABPB1-AS1可能是erastin诱导HCC细胞铁死亡的关键分子，丰富了对lncRNA调节氧化应激的认识。

3 铁死亡参与肝癌的治疗

在晚期肝癌患者中，手术和非手术治疗均未获得令人满意的结果。几种靶向药物中只有索拉非尼和雷戈非尼被证明可以成功延长HCC患者的生存期[25-26]。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，是提高HCC生存率的首个全身疗法用药，口服索拉非尼已成为美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于不可切除HCC患者的标准治疗方法[27]。它能抑制肿瘤细胞的增殖、血管生成并可促进多种肿瘤的细胞凋亡[28]。最近，有研究[29]称，索拉非尼可能会阻断Xc传输系统，从而抑制GSH的合成，其作用机制与erastin类似。随后，其他科研团队[30]也证实索拉非尼可以诱导癌细胞的铁死亡。

3.1 通过内源性途径诱导HCC细胞铁死亡

3.1.1 索拉非尼诱导HCC细胞铁死亡 目前对索拉非尼针对HCC细胞的毒性作用机制已有初步认识。最初的报道[31]是索拉非尼可诱导HCC细胞的凋亡。然而，之后发现索拉非尼单药应用于HCC细胞不能诱导与凋亡相关的主要线粒体事件，例如细胞色素C的胞质释放或胱天蛋白酶的活化[32]。此外，索拉非尼只有与化合物ABT-737结合才能成为一种有效的凋亡诱导剂。Louandre等[33]研究发现，索拉非尼对HCC细胞的毒性作用可被铁的有效化学螯合剂去铁胺(DFX)阻止。因此，索拉非尼作为单一药物应用于HCC细胞能够诱导不同于凋亡的细胞死亡。与此同时，DFX赋予的保护取决于其耗尽HCC细胞内铁存储的能力。结果表明，索拉非尼应用于HCC细胞可以诱导某种形式的细胞死亡，该死亡与铁死亡密切相关。总而言之，引发铁死亡可能是提高索拉非尼在肝癌中疗效的一种可行策略。

3.1.2 视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，Rb)蛋白调节索拉非尼在HCC细胞中引起的铁死亡 Rb蛋白可调节真核生物中一些基因的转录[34]，且Rb蛋白以其在细胞增殖中的调节作用和在G1/S检查点的关键作用而闻名，主要是其调节E2F家族转录因子活性的能力。已知Rb蛋白功能的丧失是肝癌发生过程中的一个重要事件，且针对Rb蛋白状态是否为肝癌细胞对索拉非尼反应调节因素尚在研究中。重要的是，研究[30]表明，Rb蛋白的状态是调节癌细胞对铁死亡易感性的一个参数。低表达Rb的HCC细胞暴露于索拉非尼后，细胞死亡数增加2～3倍。索拉非尼治疗的BALB/c裸鼠在接种低表达Rb的HCC细胞后所生长的异种移植肿瘤，与接种对照细胞的小鼠肿瘤稳定相比，在接受治疗的动物中有50%的肿瘤完全消退。说明暴露于索拉非尼后，肝细胞癌的Rb蛋白阴性状态会促进铁死亡的发生。该发现突显了Rb蛋白在HCC细胞中对于索拉非尼的应答和铁死亡调节的作用。

3.1.3 磷酸调节信号参与索拉非尼治疗HCC细胞诱导的铁死亡 索拉非尼如何参与诱导肝癌细胞铁死亡，一直是学者们的探索方向。Raf-Mek-Erk信号通路并不是索拉非尼诱导肝癌细胞铁死亡的重要靶点，索拉非尼有一种独特的作用方式来诱导铁死亡[33]。由于已经提出索拉非尼与其他类似的激酶抑制剂相比具有抑制Xc-系统的额外活性[35]，因此更好地理解索拉非尼调节Xc-系统活性的磷酸化变化将有助于解释索拉非尼等激酶抑制剂是如何诱导铁死亡的。Werth等[36]的研究概述了索拉非尼治疗对SKHep1细胞的早期作用：在药物治疗30 min内对蛋白质磷酸化有广泛的调节作用，而在60 min的处理后作用会更加剧烈。这项研究包括对6 170个独特磷酸位点的定量覆盖，采用无标记定量(LFQ)磷酸蛋白质组学来探测磷酸化随时间的变化。这包括Xc-的潜在结合位点上的磷酸位点，还包括已知与铁死亡相关的蛋白质上的磷酸位点。根据他们的发现，在索拉非尼治疗后，铁稳态蛋白和其他与铁死亡有关的蛋白上的许多位点都受到显著的调节。这些均指出，在铁死亡的诱导过程中可能涉及了磷酸化调节信号。

3.2 外源性途径诱导肝癌细胞铁死亡

3.2.1 双GSH耗尽型索拉非尼负载锰硅纳米药物诱导肝癌细胞铁死亡 GSH具有抗氧化和解毒能力，其水平与肿瘤进展和化疗耐药密切相关，而HCC细胞中GSH水平升高。因此，研究人员认为GSH耗竭策略将是治疗HCC的理想方法之一。Tang等[37]介绍了一种新型一锅反应，用于合成锰掺杂的介孔二氧化硅纳米粒子(锰-二氧化硅纳米粒子，MMSNs)，该反应可通过MMSNs降解引起细胞内GSH消耗来诱导肿瘤细胞的铁死亡。MMSN的锰氧化键会在高GSH浓度下断裂，从而迅速在环境中消耗GSH。1分子-Mn-O-的裂解将消耗2分子的GSH。因此，由MMSN的降解引起的GSH消耗效率足够耗尽细胞内的GSH。同时，MMSNs的降解会导致负载的索拉非尼释放，从而阻断Xc-传输系统，在用MMSNs @ SO(MMSNs负载索拉非尼)孵育后，HCC细胞中的GSH含量迅速降低，并且抑制了GSH的合成。重要的是，MMSNs @ SO对正常肝细胞(LO2细胞)的毒性要比HCC细胞低得多。他们旨在通过构建MMSNs @ SO来双向耗尽细胞内GSH而发挥优异的促铁死亡作用。结果显示，这种双重消耗GSH的纳米药物具有诱导HCC细胞铁死亡的巨大潜力，将有助于开发针对HCC的高效铁死亡诱导剂。

但是，细胞可以适应不断变化的微环境。当GSH被消耗时，GSH的合成将加速，连续的铁死亡将被抑制[38]。因此，如何抑制肝癌细胞GSH的合成，是肿瘤治疗中诱导铁死亡的另一个关键点。

3.2.2 低密度脂蛋白二十二碳六烯酸纳米粒诱导铁死亡 Sawada等[39]的流行病学研究报告称，富含多不饱和ω-3脂肪酸(ω-3PUFA)的饮食可降低肝炎患者发生HCC的风险。为此，研究人员[14]设计了一种用天然ω-3PUFA二十二碳六烯酸重构的低密度脂蛋白纳米粒子(LDL-DHA)。LDL-DHA通过铁死亡途径诱导肝癌细胞死亡，这是其抗癌活性的一种新的分子机制。LDL-DHA纳米颗粒对大鼠肝癌和人HCC细胞系均具有细胞毒性。LDL-DHA处理后，大鼠和人类HCC细胞在细胞死亡之前均经历明显的脂质过氧化，GSH枯竭和脂质抗氧化剂GPX4 失活。治疗后的肝癌细胞死亡与凋亡、坏死或自噬途径无关，与铁依赖性细胞死亡机制一致，GPX4也是LDL-DHA诱导肿瘤细胞死亡的中枢调节因子。他们进一步研究了LDL-DHA对承载人肝癌移植瘤小鼠的影响。瘤内长期注射LDL-DHA会严重抑制HCC异种移植物的生长。与体外研究结果一致，LDL-DHA治疗的HCC肿瘤经历了铁依赖性细胞死亡，其特征是组织脂质氢过氧化物水平升高和GPX4表达抑制。

LDL-DHA诱导的铁死亡可实现有效的抗肿瘤效果，因为长期的肿瘤生长抑制作用在停止治疗后仍可得到很好的维持。这些发现为LDL-DHA控制肿瘤细胞毒性的分子机制提供了新见解。

综上所述，铁死亡在HCC中起着至关重要的作用，铁死亡是诱导肝癌细胞死亡的有效机制。同时，关于肝癌中铁死亡的详细信号转导途径仍在进一步探索中，而针对索拉非尼耐药性、肝癌转移和能量代谢等，都是将来探索的方向。铁死亡可能成为肝癌药物治疗的靶标，为索拉非尼在肿瘤中的优化应用开辟新的途径。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。