饲料级柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌作用

晏家友，杜亚楠，李书伟，汤文杰，邝声耀

（1.四川省畜牧科学研究院，四川成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066；3.西南大学动物科学技术学院，重庆荣昌 402460；4.四川省畜科饲料有限公司，四川成都 610066；5.畜禽生物制品四川省重点实验室，四川双流 616200）

为了优化畜群的整体生产水平，现代化养猪生产中普遍采用仔猪早期断奶技术。早期断奶仔猪的消化系统和免疫系统发育尚不成熟，肠道微生物区系易受外界变化的影响，容易出现采食量下降、生长停滞，甚至发生腹泻和死亡等“早期断奶应激综合征”。据统计，我国每年约有1.6亿头仔猪死于腹泻。因而，断奶仔猪腹泻已成为制约生猪产业发展的重要因素，直接影响到养殖经济效益。研究发现，仔猪产生腹泻的原因有很多，其中断奶后肠道菌群的失调尤为突出。研究表明，产肠毒素大肠杆菌和猪霍乱沙门氏菌是引起断奶仔猪腹泻的主要病原菌。铜具有优良的抗菌性能，对大肠杆菌等具有杀灭作用，并且不易导致细菌耐药性产生。硫酸铜是仔猪饲料中铜的主要添加形式，但是由于其吸收率低、排放量高，已成为畜牧生产中继抗生素之后的又一大忧患。因此，新铜源的研发和应用势在必行。2019年4月16日，我国农业农村部发布的第162号公告正式批准柠檬酸铜作为新型饲用有机铜源在断奶仔猪饲料中使用。研究显示，柠檬酸铜安全性好、添加量低、排放量少，可以有效提供铜元素，促进仔猪健康生长，并可以显著降低其腹泻率。然而，关于柠檬酸铜调控断奶仔猪腹泻的作用机理尚未见研究报道。因此，本试验旨在研究柠檬酸铜对猪致病性大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌效果，为进一步开展柠檬酸铜抗断奶仔猪腹泻的机理研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 产肠毒素大肠杆菌和猪霍乱沙门氏菌由西南大学动物医学院微生物实验室保存，试验前在斜面培养基上接种。

1.1.2 铜源 饲料级柠檬酸铜（四川省畜科饲料有限公司）实测含量为99.3%，其中铜含量实测值为35.0%。

1.1.3 主要试剂 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、Mueller-Hinton琼脂培养基和MHB液体培养基等均为北京奥博星生物技术有限责任公司产品。

1.1.4 仪器设备 试验所需仪器设备主要包括超净工作台（Airtech）、高压蒸汽灭菌锅（Panasonic）、恒温培养振荡器（Crystal）、恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）和电子天平（Precisa）等。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 利用营养琼脂培养基与营养肉汤培养基对大肠杆菌和沙门氏菌进行培养，采用无菌生理盐水配制成0.5 McFarland浓度的菌悬液。

1.2.2 柠檬酸铜溶液的制备 将柠檬酸铜溶解后，分别配制成浓度为0.15 g/mL（铜含量26.5 mg/mL）、0.20 g/mL（铜含量35.3 mg/mL）和0.25 g/mL（铜含量44.1 mg/mL）的柠檬酸铜溶液；同时配制不含柠檬酸铜的溶液作为对照。

1.2.3 抑菌圈直径测定 参照《抗菌剂药敏纸片》（YY/T 1191-2011），利用Mueller-Hinton琼脂培养基进行纸片扩散试验。将6 mm定性滤纸小圆片分装于洁净干燥烧杯内，高压蒸汽灭菌后备用。无菌操作下，将灭菌滤纸片浸于1 mL各浓度柠檬酸铜溶液中。吸取200 μL菌悬液均匀涂于培养基中。采用无菌镊子夹取浸泡后的滤纸片贴于培养基上，每个浓度重复4次，然后置于37℃恒温培养24 h，游标卡尺测量抑菌圈直径。抑菌敏感度判断标准：抑菌圈直径（d）＞20 mm为极敏、15 mm＜d≤20 mm 为高敏、10 mm＜d≤15 mm为中敏、d≤10 mm 为低敏，无抑菌圈为不敏感。

1.2.4 最小抑菌浓度测定 参考牛彪等试验方法，利用MHB液体培养基进行倍比稀释试验。将已灭菌试管排于超净工作台，每一排9支试管分别编号1～9号，向每支试管中加入1 mL MHB液体培养基。吸取0.25 g/mL柠檬酸铜溶液1 mL于第1号试管，连续吹打混匀后，采用倍比稀释法取1 mL柠檬酸铜溶液至第2、3、4、5、6、7、8号试管，配制成不同浓度的柠檬酸铜溶液。向1～9号试管中分别加入3.8 mL MHB液体培养基，然后向1～7号及9号试管中分别加入200 μL菌悬液。前7号试管中含有的柠檬酸铜浓度分别为25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625 mg/mL，8号试管不加菌液作为液体培养基及空白对照，9号试管不加柠檬酸铜溶液作为阳性对照。将试管放入37℃恒温培养振荡器中培养24 h，然后从各试管中吸取200 μL培养液于培养基，再用涂布棒涂匀后于37℃培养24 h，观察是否有菌落生长，判断柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC，未出现菌落生长的最低浓度）。

1.3 统计分析 数据经Excel 2010处理后，利用SPSS 22.0统计软件进行方差分析，差异显著时采用Duncan′s法进行多重比较，试验结果以平均值±标准差表示，以＜0.05为差异显著判断标准。

2 结果

2.1 柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈直径的影响由表1可知，与对照组相比，0.15、0.20、0.25 g/mL柠檬酸铜组大肠杆菌抑菌圈直径分别提高36.05%（＜0.05）、56.40%（＜0.05）和92.91%（＜0.05），沙门氏菌抑菌圈直径分别提高9.38%（＞0.05）、48.23%（＜0.05）和113.40%（＜0.05）。

表1 柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈直径的影响 mm

由图1和图2可知，大肠杆菌对0.15、0.20 g/mL柠檬酸铜表现出中度敏感，大肠杆菌对0.25 g/mL柠檬酸铜表现出高度敏感；沙门氏菌对0.15 g/mL柠檬酸铜表现出低度敏感、对0.20 g/mL柠檬酸铜表现出中度敏感、对0.25 g/mL柠檬酸铜表现出高度敏感。

图1 柠檬酸铜对大肠杆菌的抑菌圈直径

图2 柠檬酸铜对沙门氏菌的抑菌圈直径

2.2 柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度测定 柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度均为6.25 mg/mL，即柠檬酸铜稀释倍数为40。

3 讨 论

铜是动物机体必需的微量元素，在促进动物生长、增强免疫功能、改善肤色毛况和提高繁殖性能等方面发挥着重要的营养生理作用。冷向军等研究发现，在断奶仔猪日粮中添加250 mg/kg硫酸铜，仔猪腹泻率降低了35.39%。梅绍锋进一步研究指出，随着日粮中铜的添加量提高，仔猪的腹泻率逐渐降低，其中铜添加量为250 mg/kg时仔猪腹泻率较基础日粮组显著降低。高剂量硫酸铜的抗腹泻作用可能因其在动物消化道内发挥了类抗生素的抗菌作用，进而改善了消化道内环境。但是，“高铜”的使用对动物自身、生态环境及动物产品的品质都构成了潜在的危害。柠檬酸铜是柠檬酸与铜离子形成的化学结构稳定、生物学效价高的离子型化合物，也是我国食品营养强化剂标准中允许使用的有机铜源。铜的配位可以增强柠檬酸的生物活性，因而柠檬酸铜对细菌和真菌都具有明显的抑制效果。现有研究结果显示，在断奶仔猪日粮中添加低剂量的柠檬酸铜可以达到添加高剂量硫酸铜相近的促生长效果，并可增强断奶仔猪的抗腹泻能力。Peng等进一步研究发现，柠檬酸铜可以显著降低盲肠大肠杆菌数量，提高乳酸杆菌数量，从而降低幼龄动物的腹泻率和死亡率。本试验研究结果表明，0.20 g/mL柠檬酸铜和0.25 g/mL柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径显著高于对照组；且随着柠檬酸铜浓度升高，大肠杆菌和沙门氏菌对柠檬酸铜的敏感度增强，其中大肠杆菌和沙门氏菌对0.25 g/mL柠檬酸铜均表现出高度敏感。此外，柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度均为6.25 mg/mL。综合分析，饲料级柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌均具有较好的抑菌效果。

4 结 论

本试验条件下，0.20 g/mL柠檬酸铜和0.25 g/mL柠檬酸铜组大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径较对照组显著提高；大肠杆菌和沙门氏菌对0.25 g/mL柠檬酸铜表现出高度敏感；柠檬酸铜对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC均为6.25 mg/mL。