70株室间质量评价菌株鉴定差异及其纠正方法探讨

马 爽，汤凤珍，杜利军，伍国达，冯 峰，程 璐，马 翔

1.广东省广州市花都区妇幼保健院检验科，广东广州 510800；2.广东省广州市花都区人民医院检验科，广东广州 510899；3.广东省江门市中心医院检验科，广东江门 529030；4.广东省广州市花都人爱医院检验科，广东广州 510800

随着自动化微生物鉴定仪、基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的广泛应用，极大地提高了临床微生物的鉴定能力。由于临床微生物的种、属繁多，存在多样性、复杂性，选择的鉴定特征可能难以代表全部的被鉴定菌株，特别是少见菌、疑难菌、分类“未明确菌”。当“试验组合”不是所鉴定菌属、菌种“独有的”特征时，会出现不明确、不能鉴定、近缘菌株不能区分的“不确定”结果。自动化微生物鉴定系统根据“固定的”生理生化特征，不能自动补充鉴别试验，是导致菌株鉴定为复合群、低分辨率或者不能鉴定的原因之一。显色培养基虽具有快速筛查目标菌的优势，但对于产生类似色素的菌株还需要进一步鉴别。志贺菌属、沙门菌属、大肠埃希菌O157、霍乱弧菌等经过生化特征鉴定后，还需要血清学的确认。微生物的药敏试验需要根据菌株种类选择药物[1]，因此鉴定结果的错误可能影响到药敏结果的判读和临床用药。为此，笔者探讨了“不确定”菌株的进一步鉴定，以得到明确的病原菌鉴定结果[2-8]，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1试验菌株 对国家卫生健康委临床检验中心及广东省临床检验中心提供的室间质量评价菌株进行鉴定，将其中经自动化微生物鉴定系统鉴定为“不确定”菌和在不同显色平板上产生类似色素的菌(非目标菌)共70株作为试验菌株。

1.2仪器与试剂 全自动微生物分析仪Vitek 2 Compact、革兰阳性菌鉴定卡(GP卡)、革兰阴性杆菌鉴定卡(GN卡)和MALDI-TOF MS Vitek MS均购自法国生物梅里埃公司；DHP-9052型电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。用于念珠菌、小肠结肠炎耶尔森菌和沙门菌鉴定的显色平板，采用法国科玛嘉公司生产的干粉配制；显色平板及哥伦比亚血平板均从广州迪景微生物试剂有限公司购进。微生物生化鉴定微量管以及氧化酶纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司，丁酸酯酶纸片购自Remel公司，3%过氧化氢试剂自配。志贺菌属、大肠埃希菌O157:H7、沙门菌属诊断血清购自丹麦国家血清研究院、中国兰州生物制品研究所。仪器设备均按说明书操作，所有试剂均在使用有效期内。

1.3方法 取试验菌株35 ℃孵育18～24 h的血平板生长物进行革兰染色，革兰阳性菌补充过氧化氢酶试验，革兰阴性菌补充氧化酶、葡萄糖氧化/发酵(O/F)和动力试验。凡菌株在Vitek 2 Compact、Vitek MS上鉴定为“不确定”菌的，行补充试验鉴别。对在显色平板上产生类似色素的菌株，同时采用Vitek 2 Compact、Vitek MS鉴定；对出现鉴定差异的菌株行补充试验确认。志贺菌属、大肠埃希菌O157:H7和沙门菌属菌株采用特异性血清学鉴定(均做盐水对照)。

2 结 果

2.1试验菌株自动化微生物鉴定系统鉴定结果 70株试验菌株经Vitek 2 Compact、Vitek MS鉴定出现“不确定”菌共计32株，见表1。其中Vitek 2 Compact能够鉴定志贺菌属与大肠埃希菌O157:H7菌株共11株(均经过特异性的血清学鉴定)，其他21株“不确定”菌需要进一步鉴别到种，占65.6%(21/32)；Vitek MS能够鉴定鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌、肺炎链球菌、缓症链球菌、新洋葱伯克霍尔德菌、快速生长分枝杆菌、诺卡菌共13株，其他19株“不确定”菌需要进一步鉴别到种，占59.4%(19/32)；部分菌株在两种鉴定系统间出现鉴定差异。从鉴定的菌种比对看出，Vitek MS较Vitek 2 Compact可鉴定的微生物种类增多，具有对Vitek 2 compact不能鉴定菌株鉴定的优势，但是，其对于志贺菌属菌株、大肠埃希菌O157:H7不能明确鉴定。

表1 自动化微生物鉴定系统的“不确定”菌

2.2“不确定”菌Vitek 2 Compact与Vitek MS鉴定结果的差异及鉴别 通过不同鉴定系统及表型特征的互补、结合血清学试验，均可以鉴定到种/型。通过同一菌株在不同系统上的鉴定比对，大多数菌种的鉴定结果是相符合的，但少数菌种有差异，见表2。

表2 “不确定”菌Vitek 2 Compact与Vitek MS鉴定结果的差异及鉴别

2.3试验菌株显色平板筛选结果 70株试验菌株在不同显色平板上产生类似色素的菌有38株，均确定为非目标菌(包含自动化鉴定系统鉴定的同种菌株)，见表3。

表3 不同显色平板筛选的非目标菌

续表3 不同显色平板筛选的非目标菌

2.4非目标菌Vitek 2 Compact与Vitek MS鉴定结果的差异及鉴别 都柏林念珠菌在念珠菌显色平板也是绿色菌落，对于此平板上生长的绿色菌落的菌株需要鉴别；气单胞菌在CIN平板也是红色菌落，根据氧化酶试验(+)即可排除小肠结肠炎耶尔森菌；在沙门菌显色平板上为红色菌落的非沙门菌包括多个菌属，通过氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶、动力、MUG等试验鉴别，见表4。

表4 非目标菌Vitek 2 Compact与Vitek MS鉴定结果的差异及鉴别

2.5新洋葱伯克霍尔德菌鉴定 新洋葱伯克霍尔德菌在血平板上35 ℃孵育24 h，菌落细小，延长孵育时间菌落增大，圆形、凸起、光滑、湿润。该菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验(+)、葡萄糖O/F试验为氧化型。洋葱伯克霍尔德菌群种间的表型特征非常相似，即使补充试验鉴别，菌种的鉴定仍然困难，MALDI-TOF MS有鉴别优势。新洋葱伯克霍尔德菌在Vitek 2 Compact上的鉴定结果为洋葱伯克霍尔德菌群(置信度94.0%)；Vitek MS质谱仪鉴定结果为新洋葱伯克霍尔德菌(置信度99.9%)。如果需要进一步鉴定到种水平，其鉴别特征见表5。

表5 洋葱伯克霍尔德菌群种间鉴别特征

3 讨 论

任何微生物鉴定系统都有鉴定菌种的范围，实验室人员要了解应用系统的鉴定菌谱。通常自动化微生物鉴定系统能够对大多数临床常见菌株鉴定到种，但对少部分菌株只能鉴定到复合群，需要补充鉴别试验才能鉴定到种水平，这关系到药敏试验的结果解释。同一菌株在不同系统上进行鉴定比对，少数菌株有差异，这会导致实验室间、或者实验室内使用不同的鉴定系统的结果不符合，因此，微生物实验室需要重视类似菌株的鉴别，做到准确基础上的可比。Vitek 2 Compact操作手册指出了一些菌属、菌群的菌株需要进一步鉴别。

不同菌属的培养条件、菌落形态、色素、气味以及染色性质、菌体形态、动力等不尽相同，甚至有“独特性”，这是自动化微生物鉴定系统尚不能替代的。细菌的革兰染色是全自动微生物分析仪鉴定的重要方向性试验，如果革兰阴性菌错用GP卡可能有鉴定结果，但得到的结果南辕北辙，反之亦然。而显色平板是专为目标菌的快速“筛选”研制的，其根据微生物特定的酶水解底物显色，且目标菌在此培养基上生长良好，显色快、颜色鲜艳而容易识别。虽然显色平板中的抑菌剂会抑制“杂菌”的生长，但是，本试验在念珠菌等3种显色平板上观察到38株产生类似色素的菌株，其鉴定的结果都不是目标菌株。因此，不能仅仅根据在显色平板上菌落的色素而未经鉴定就直接发出报告，还需要进行鉴定确认，谨防误报。因此，对于自动化微生物鉴定系统鉴定为“不确定”、或者显色培养基“筛查”的菌株，需通过不同的方法互补，提高微生物鉴定的质量。快速生长分枝杆菌、诺卡菌根据培养特性、菌落形态、菌体抗酸染色特征，可以初步识别。

MALDI-TOF MS尚不能准确鉴定志贺菌属细菌、大肠埃希菌O157，可能对患者的诊治造成影响。对于来自粪便标本报告的大肠埃希菌，要做进一步甄别，报告正确的病原学结果，其对临床治疗有重要意义。

本研究对70株试验菌株的鉴定结果与国家卫生健康委临床检验中心及广东省临床检验中心反馈的鉴定结果一致。本研究列举了“不确定”菌的鉴定及鉴别，但存在鉴定差异的菌株不仅限于此[9-10]，由于试验菌株数量有限，有待进一步观察。下列菌株鉴定错误可能影响疾病的诊断与治疗。

病例概况1：福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、痢疾志贺菌2型及宋内志贺菌从不洁饮食腹泻患者的粪便中检出，部分菌株也从健康带菌者粪便中检出。志贺菌属是主要的肠道病原菌之一，引起人类细菌性痢疾，严重感染时可出现全身中毒症状。

病例概况2：大肠埃希菌O157:H7从一名14岁男性腹痛患儿的血便中检出。大肠埃希菌O157为高致病性细菌，能导致出血性肠炎、甚至严重的溶血性尿毒症综合征。

病例概况3：新洋葱伯克霍尔德菌从一名84岁女性呼吸机相关性肺部感染患者的吸痰标本中检出。新洋葱伯克霍尔德菌是此菌属最常见的菌种之一，肺部感染难以治疗，由于感染的患者术后预后差，将其感染视为肺移植术的绝对禁忌证。

病例概况4：鹑鸡肠球菌从一名78岁女性肾盂肾炎患者的尿液中分离出来。鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌还可引起腹腔、盆腔及胆管等部位感染。铅黄肠球菌和鹑鸡肠球菌均对万古霉素天然低水平耐药，而粪肠球菌和屎肠球菌对万古霉素是获得性耐药，这2类肠球菌的鉴别对临床治疗有重要意义。

综上所述，通过不同鉴定方法的互补，可以提高临床微生物的鉴定质量。