Pax3a基因Homeobox domain结构域敲除斑马鱼的跨代遗传观察

孙潇潇, 詹睿, 李乐诗, 范纯新, 严继舟

(上海海洋大学 1.水产科学国家级实验教学示范中心； 2.农业部淡水水产种质资源重点实验室；3.农业部鱼类营养与环境生态研究中心； 4.海洋生态系统和神经科学研究所， 上海 201306)

Pax基因最初是在果蝇中发现了调控胚胎体节形成的基因，这种基因都含有配对盒，其所编码的蛋白质是胚胎生长发育极为重要的高度保守的转录因子[1].在人类Pax3基因突变后，会引起瓦登伯革氏症候群(Waardenburg syndrome,WS)[2]，临床特征为听力障碍、白额发、虹膜异色症、鼻根宽阔、眉毛中部多毛以及眼睛内眦异位、先天性巨肠结等症状[3-4].杂合子Pax3的WS表型的不完全外显和致病基因的多样性导致其具有高度的临床和遗传异质性.与WS 相关的基因均参与神经嵴的发育，在神经嵴的发育中发挥重要的调控作用.

Pax3基因的表达与许多生命活动密切相关，特别是发育早期和再生过程.斑马鱼基因组中Pax3直系同源基因有Pax3a和Pax3b两个亚型[1,5].Pax3a中共包含4个结构域，分别为paired box domain；Homeobox domain；paired box domain 7；g-protein pathway suppressor.前期研究显示胚胎期过表达这4个结构域可以导致斑马鱼产生多表型复杂的WS突变体，而且每个结构域过表达出现交叉表型[6].为了进一步验证Pax3a结构域对WS表型的作用，本研究利用CRISPR/Cas9技术[7-10]敲除Pax3a的结构域，并跟踪两年观察敲除后的跨代遗传.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN)、转录试剂盒(NEB)、RNA纯化试剂盒(ZYMO RESEARCH)、pEASY-T3 Cloning Kit试剂盒(北京全式金公司)、AxioCam MRc体视镜(Zeiss).

1.1.2 实验用鱼

亲本为野生型AB斑马鱼，利用CRISPR/Cas9技术双靶点整体敲除斑马鱼中Pax3a的Homeobox domain 结构域.得到的敲除后的F0代(HD)与野生型(WT)杂交获F1代单个结构域缺失杂合子，F1代内杂交得F2代.本实验没有成功产生纯合F2代.饲养条件为27 ℃，14 h光照、10 h黑暗.每天早晚各喂一次斑马鱼，成鱼的食物是丰年虾幼体，幼鱼是草履虫.

1.1.3 引物设计

在双靶点的前后分别设计引物.所用PCR引物根据ucsc网站提供斑马鱼Pax3a基因序列来设计所需要的前后引物.需要注意的是前后引物不能距离sgRNA靶向切除位点太近.

Homeobox domain F Primer：GGGGCTTTCGA-GGCGTATT

Homeobox domain R Primer：CGGCCACATAT-CCATCTGAGT

1.2 实验方法

1.2.1 CRISPR/Cas9敲除设计

首先使用NCBI网站上查找Pax3基因在斑马鱼体同源基因Pax3a的结构域信息， 其中Homeobox domain在CDS 中的位置为Homeobox domain: CDS 222-275.Homeobox domain由部分5号外显子和部分6号外显子组成.

为了获得单个结构域的突变体，采用两边同时突变的方式，目标剪切位点在内含子上，两个剪切位点中间所包含的外显子碱基数目为3的倍数，这样就不会切除位于前面的结构域而导致后面的结构域移码被破坏.分别在Pax和Homeobox domain的中间设计sgRNA(sgRNA2)、Homeobox domain的右端设计sgRNA(sgRNA3),敲除策略示意图如下(图1A).

同时使用sgRNA2和sgRNA3双靶点将整个Homeobox domain切除，且sgRNA2和sgRN3之间的外显子的碱基数目是3的倍数，这样就保证了在切掉Homeobox domain整个结构域时不会影响其他结构域.

再使用CRISPRscan(http://www.crisprscan.org)找到合适的敲除靶点设计sgRNA.送生工生物工程公司(上海)合成sgRNA的DNA序列，然后转录成RNA.设计的sgRNA的DNA序列如下：

sgRNA2:taatacgactcactataGGGAATCTGTACC-CAGAGGAgttttagagctagaa

sgRNA3:taatacgactcactataGGTCCGAGACTGA-ACAGAGAgttttagagctagaa

1.2.2 检测基因敲除效果

检测基因编辑是否成功是通过在双靶点的前后分别设计引物，在显微注射24 h后随机挑取几颗鱼卵,粗提DNA,使用设计的Genotyping检测引物进行聚合酶链式反应，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小；并送至生物公司(金唯智生物科技有限公司)测序.

1.2.3 观察表型及HE病理切片

对结构域敲除后产生的大的F0、F1代的突变体进行表型跟踪观察.对比同一时期野生型斑马鱼与敲除后斑马鱼的色素变化，鱼眼球的眼瞳、内眦、外眦，形体变化以及存活情况等.将有显著表型变化的鱼做HE染色，并对病理切片拍照观察.

1.2.4 检测F0、F1代结构域敲除后基因序列变化

分别取F0代、F1代以及同等条件下生长、生理状态相同的野生型斑马鱼，麻醉后切除鱼尾，抽提DNA后.粗提DNA进行聚合酶链式反应 (PCR)，琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小后，将粗提DNA送至生物公司进行测序.将F0代、F1代测序结果与斑马鱼Pax3a基因序列在SnapGene软件中进行比对，通过观察Homeobox domain结构域区域是否发生改变，进一步了解基因敲除后斑马鱼基因组的稳定性.

2 结果

2.1 敲除后突变体靶基因序列检验

使用前面设计的检测引物检测3个结构域是否完全敲除.根据理论上的剪切位点与检测的前后引物的距离可算，若整个敲除Homeobox domain结构域成功，则目的条带约为256 bp.Homeobox domain的泳道跑出约250 bp大小的条带，即Homeobox domain可能敲除成功 (图1B).

A: 斑马鱼结构域敲除方法示意图; B：F0代斑马鱼的突变体PCR鉴定电泳图. B-1代表野生型对照，B-2代表Homeobox domain敲除突变体.A: Knockout design for four domains of Pax3a; B: Identification of F0 mutations. B-1 is wild type, B-2 is Homeobox domain mutation.

为了进一步证明敲除成功，对目的片段PCR产物进行了切胶回收、克隆并转化.在涂板后12 h挑取单菌落，使用载体的前后引物M13 F Primer和M13 R Primer进行PCR鉴定,并将代表样品送去生物公司进行菌液测序.将测得的序列放进ucsc中与斑马鱼的序列进行比对，证实Homeobox domain结构域完全被敲除.

2.2 跨代遗传检测

通过两年的跟踪观察，发现F1代3个结构域敲除突变体存活率有很大差异.截至2021年4月，Homeobox domain突变体剩有7条，结构域敲除存活率与文献[6]报道的结构域过表达突变体存活率大体类似，且存活的Homeobox domain突变体出现显著WS肠道病变表型，本研究着重探讨Homeobox domain基因敲除鱼的跨代遗传.

自成功敲除F0代的Homeobox domain后，约2个月，F1代成鱼DNA经PCR扩增后，电泳结果预期片段大小.电泳结果如图2A所示，7条Homeobox domain突变体中，2条基本保持F0代结构域敲除基因型，余下5条没有检测到预测靶序列敲除基因型.挑出扩增较好、条带较明显的DNA样品测序(图2B).在SnapGene软件上将F0代、F1代测序结果进行序列比对，比对结果如图2C.序列比对结果显示，F1代扩增出的片段与F0代扩增出的片段都缺失Homeobox domain结构域，但F1代的缺失部分比F0代多，在后端多缺失39bp.在F1代中，那5条未检测到Homeobox domain结构域缺失的个体(占比71%)可能出现重组修复[10].

A: F1代敲除鱼检测结果; B: F1、F0代测序结果; C: 序列比对图 A: Genotyping of F1 knockout fish; B: Sequence result of F1 and F0; C: Alignment results of F0 and F1 sequences

2.3 表型及组织形态学改变

对敲除Homeobox domain结构域后的1个月大的F0、F1代的鱼进行表观形态观察.与同一时期的野生型斑马鱼对比，敲除后的斑马鱼色素变化并不明显.通过测量计算眼球的内眦与外眦比[6]、眼瞳与眼球的直径比，发现左右眼眼瞳之比差异不明显，但内外眦之比差异较明显(图3).F0、F1代均有基因敲除鱼出现腹部胀大并逐渐成半透明状，剖开后内脏呈糜状，流出的是淡黄色腹水，鱼鳍颜色加深并出现分支，腹背花纹呈“8”字型，色素颗粒比较松散.图4显示鱼龄14个月F1表型.如图5 HE染色所示，F1代斑马鱼对照组中肠肠绒毛结构完整，上皮层细胞排列紧密，间或有杯状细胞，固有层密集.敲除组斑马鱼中肠绒毛结构损坏，间隙增宽，肠道绒毛脱落甚至黏膜脱落，排列无序，肠道黏膜上皮细胞失去原有的紧密连接.未见有明显的炎性细胞.

1)P<0.05.WT：野生型; HD：Homeobox domain敲除型; L：左眼眼瞳比; R：右眼眼瞳比; N：内外眦比 WT: wild type; HD: Homeobox domain deletion; L: left eye; R: right eye; N: inner canthus

A、D：背部(×10)； B、E：臀鳍(×10)； C、F：腹部(×4)A,D: Zerbrafish back(×10)； B,E: Anal fin(×10)； C,F: Belly(×4)

图5 野生型鱼(左)与基因敲除鱼(右)的中肠(×20)

3 讨论

本研究利用CRISPR/Cas9双靶点技术，整体敲除斑马鱼中Pax3a的Homeobox domain结构域，得到敲除后的F0代和杂合型的F1代斑马鱼.通过两年的追踪观察发现，目的基因序列和转基因鱼表型出现进行性改变，根据序列比对结果显示，F1代扩增出的片段与F0代扩增出的片段都缺失Homeobox domain结构域，但F1代的缺失部分比F0代多，在后端多缺失39bp.另外，在F1代中，存在未检测到有Homeobox domain结构域缺失的个体(占比71%)，推测可能是斑马鱼基因组修复的结果[11-12]，也说明基因敲除不能完全保证基因组稳定性.除了色素和眼睛的改变类似WS2的表型外，本研究还发现Homeobox domain结构域敲除后会产生类似WS4的肠道突变表型.

Homeobox domain结构域是所有同源异型盒基因(Homeobox)含有的高度保守的同源序列，长183bp，编码61个氨基酸.Homeobox(Hox)基因包括Hox和非Hox基因两大类，在恶性肿瘤中会异常表达.在斑马鱼中，Hox共有7个线性排列的Hox基因簇，分别是HoxAa、HoxAb、HoxBa、HoxBb、HoxCa、HoxCb、HoxD[13-14].Hox基因有明显的时间表达顺序以及位置特异性[14]，脊椎动物的消化道发育也符合这个规律：自前向后的分化.Hox基因在消化道发育过程中的内胚层、中胚层表达，并且可持续表达至成年，因此，该基因与消化道的发育及其畸形有关[15-17].斑马鱼的肠道没有哺乳动物的5种肠段，但结构相似，分为前肠段、中肠段以及后肠段.以往研究相对较多的是HoxB7和HoxB8，这两种基因的表达具有时间和空间的线性排列关系，越靠近3’端的基因越早表达，越靠近消化道的近端表达，越靠近5’端的越晚表达，离消化道尾端越近[12].有几种Hox基因在胃肠道癌症中具有特定作用.例如，食管鳞状细胞癌中的HoxA13,胃癌和结肠直肠癌中的HoxB7;HoxB13通过靶向雄激素受体信号传导和控制其他相应基因，抑制前列腺癌的发生[17-19].目前，尚不清楚具体是哪几种基因簇与WS4肠道现象有关，据以上所述，可以认为Hox同源盒基因的异常表达可能是消化道和其他癌变的潜在机制.结合前期的结构域过表达表型[6]和本研究的结构域敲除表型，我们认为细胞迁移，特别是眼部、色素和各种神经嵴起源细胞的迁移是Pax3a的特异表型，而肠道黏膜出现的改变类似表皮-间质转化 (EMT)，可能是Pax3基因突变引起消化道等癌变的分子机制，也涉及内脏神经节细胞[18,20].与Homeobox domain结构域过表达会抑制细胞迁移相反[6]，Homeobox domain结构域敲除则促进细胞迁移.总而言之，无论是结构域过表达还是选择性敲除都充分证明Homeobox domain结构域的主要功能是调节靶细胞迁移，是维持Pax3基因结构和功能的完整性所必需的.

Pax3基因，作为一类进化保守的转录因子，对许多器官系统的发育至关重要，该基因包含的Hox序列决定着动物体节和器官的发生、相对位置以及数量等[14].Homeobox domain结构域本身具有DNA结合功能调节下游基因转录，但是结合靶基因的特异性与HD结构域两侧的序列和协同因子相关[19]，即与Homeobox domain结构域相关的互作蛋白影响了Homeobox domain蛋白的功能[20].综上所述，本研究为深入探究Homeobox domain结构域与瓦登伯革氏综合征奠定了一定基础，也为临床治疗提供了理论依据，同时提示基因敲除可能影响基因组稳定性.

作者贡献声明

孙潇潇：实验操作，结果分析和论文撰写；詹睿：实验操作，结果分析和论文撰写；李乐诗：实验操作，结果分析和论文撰写；范纯新：项目设计，结果分析和文章修改；严继舟：项目设计，结果分析和文章修改.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.