高效液相色谱法测定他达拉非中11个杂质

聂忠莉，曾胜莉，王晓玲，萧茂玲，黄金玉

(1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106；2.成都克莱蒙医药科技有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

他达拉非(Tadalafil)是一种口服磷酸二酯酶V型(PDE5)抑制剂，用于治疗男性勃起功能障碍(MED)[1-2].他达拉非是由起始物料D-色氨酸甲酯盐酸盐(SM1)和胡椒醛(SM2)合成[3-5]，化学名为(6R-12aR)-6-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-2-甲基-2,3,6,7,12,12a-六氢化吡嗪并[1′,2′-1,6]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮.目前对他达拉非的降解产物及可能存在的杂质相关研究较少，故本研究参考相关标准中他达拉非中有关物质的测定方法，探索高效液相色谱法将他达拉非与其11个已知杂质(结构见图1)有效分离的检测条件[6-8]，初步确定测定他达拉非中11个已知杂质的检测方法，并对该方法进行方法学验证.最终利用确定的方法测定中试样品中杂质的含量，为控制他达拉非质量提供依据.

图1 他达拉非及杂质的结构式

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Agilent 1260型液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，Waters 2695型液相色谱仪(沃特世公司)，UV759CRT型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，BP-210D型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司).

1.2 试 药

他达拉非(批号，190501S、190502S、190503S)、杂质L(批号，20190501S，纯度为98.86%)、杂质N(批号，20191120，纯度为97.91%)，购自四川省旭晖制药有限公司；他达拉非对照品(批号，F0L003，含量为99.9%)，由美国药典委员会提供；杂质D(批号，P-RXX-57-0，含量为98.01%)，购于深圳大力水手生物科技有限公司；杂质F(批号，18-11-0842，含量为97.06%)、杂质G(批号，20-08-0614，含量为97.19%)、杂质S(批号，19-08-2804，含量为98.46%)、杂质V(批号，19-09-2018，含量为96.72%)、杂质W(批号，21-01-0101，含量为90.55%)，购于美国SINCO公司；杂质I(批号，18-T03579-02，含量为96.4%)，购于加拿大RXA化学公司；杂质K(批号，1-ALN-19-2，含量为97%)，购于加拿大TRC公司；SM2(批号，PH-18010，含量为99.92%)，购于四川惠泉生物科技有限公司；甲醇、乙腈与异丙醇为色谱纯试剂；三氟乙酸为分析纯试剂.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB C84.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.1%三氟乙酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为285nm，柱温为40℃，样品盘温度为5℃，流速为1.0 mL/min,进样体积20μL.

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液

取本品适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL含1.0 mg的溶液.

2.2.2 对照品溶液

精密称取他达拉非杂质F、杂质D、杂质I、杂质G、SM2、杂质K、杂质L、杂质V、杂质S、杂质W及杂质N适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL含SM2、杂质V、杂质S和杂质W各约0.5 μg，其余杂质各约含1.0 μg的混合溶液.

2.2.3 对照溶液

精密量取他达拉非供试品溶液0.1 mL，加甲醇定量稀释至100 mL，制成每1 mL中含他达拉非1.0 μg的对照溶液.

2.2.4 系统适用性溶液

精密量取他达拉非对照品及他达拉非杂质A适量，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中含他达拉非对照品1 mg和他达拉非杂质A 1 μg的混合溶液.

2.3 系统适用性要求

在系统适用性溶液色谱图中，他达拉非与杂质A依次出峰，理论塔板数按他达拉非峰计算不得低于5 000，他达拉非峰与杂质A峰之间的分离度应大于3.0.取“2.2.3”项下的对照溶液20 μL注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使色谱图中他达拉非的峰高约为满量程的20%.

2.4 专属性试验

按“2.1”项下的色谱条件，对他达拉非(批号190501S)强制降解试验后的样品进行测定，结果见表2.

表2 专属性试验结果

由表2可知，空白不干扰样品测定，他达拉非较稳定，仅在酸与碱破坏条件下产生降解杂质，且主要降解杂质为杂质A(异构体测定项下控制).主成分峰与杂质峰分离度较好，主峰纯度符合要求，破坏后各样品的物料平衡均在90%～110%之间，表明方法专属性较好.

2.5 检测限与定量限

取“2.2.2”项下的混合溶液适量，用甲醇稀释至一定浓度，取此溶液按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，同时走空白基线，以仪器基线噪音3倍峰高作为检测限，仪器基线噪音10倍峰高作为定量限，得各杂质的检测限与定量限，结果见表3.

表3 检测限与定量限测定结果

2.6 线性范围

研究各杂质在10%-1 000% 浓度范围内，各杂质峰面积与浓度之间的线性关系，结果见表4.

表4 线性范围测定结果

2.7 回收率

精密称取11份他达拉非样品，其中2份加甲醇溶解并稀释制成每1 mL约含1 mg的溶液，作为空白供试品溶液，另9份分别加入50%、100%与150%限度浓度的已知杂质，每个浓度配制3份供试品溶液，测定样品中各杂质的含量，计算回收率及RSD值，结果见表5，各杂质回收率良好.

表5 杂质平均回收率

2.8 精密度

他达拉非原料中不含已知杂质F、杂质D、杂质I、杂质G、SM2、杂质K、杂质L、杂质V、杂质S、杂质W及杂质N，重复性试验采用加样方式，测定重复6份样品中各杂质含量的变异程度，结果6份样品中各已知杂质含量RSD分别为2.49%、3.35%、4.09%、6.78%、1.02%、2.10%、2.26%、1.65%、1.00%、1.26%及1.87%，重复性试验良好.

由甲、乙两位研究员在不同仪器、不同时间上对同一批号样品测定12次，各杂质平均含量的RSD分别为2.27%、2.53%、3.28%、6.24%、1.73%、2.48%、2.24%、2.88%、1.44%、4.57%及1.84%，中间精密度良好.

2.9 耐用性

按“2.1”项下的色谱条件，在流速、柱温以及流动相中三氟乙酸的量发生微小改变时，对加样样品进行测定，结果显示，样品中杂质个数和杂质量以及各成分峰之间的分离度与原条件几乎无变化.当更换成不同型号色谱柱时，他达拉非峰与杂质峰、杂质峰与杂质峰之间的分离度未符合要求，由此可知，在色谱柱不发生变化的情况下，本方法的耐用性能良好.

2.10 样品测定

分别取3批他达拉菲中试样品，按“2.2”项下的方法配制供试品溶液和对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法计算样品中11种杂质的含量，结果见表6.

表6 3批中试样品中11种杂质的检测结果

3 讨 论

在对测定波长进行考察时，他达拉非及他达拉非各杂质都具有不同的紫外特征峰，但在285 nm附近均有吸收，参考相关标准及文献有关物质的检测波长，最终选择285 nm作为本品有关物质的检测波长[9].

本研究对稀释剂进行了筛选，分别采用50%乙腈、乙腈、甲醇以及乙腈—异丙醇(1∶1)等溶剂溶解并稀释制成每1 mL含杂质各约1 μg，他达拉非1 mg的混合溶液，作为系统溶液，进样测定.结果在纯乙腈和乙腈—异丙醇(1∶1)体系中，各杂质峰型较差，理论板数低.取系统溶液在50%乙腈和甲醇溶剂中分别于不同时间进样测定，考察峰面积变化情况，结果杂质H和杂质W的峰面积均呈逐渐下降趋势，控制样品盘温度在5℃可以减缓下降趋势，在甲醇中的稳定性略优于50%乙腈，因此选择甲醇作为本品的稀释剂.