膀胱尿路上皮癌中LC3B与SQSTM1的表达及其临床意义

徐芳华，巢海潮，邓雷弘

自噬(autophagy)又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是指细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和Ⅱ型程序性细胞死亡受损细胞器获得存活所需的营养和能量物质的生物学过程[1]。在正常生理情况下，细胞自噬有利于机体保持自稳状态[2]。近年研究表明，自噬在肿瘤发生、侵袭转移的过程中发挥重要作用[3]。微管相关蛋白1轻链3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3β, LC3B)及选择性自噬接头蛋白1(sequestosome 1， SQSTM1)是自噬形成的关键蛋白。本文通过免疫组化MaxVision法检测LC3B与SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中的表达，分析LC3B与SQSTM1表达与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的关系，旨在为膀胱尿路上皮癌的诊断和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月～2018年12月南方医科大学附属萍乡医院收治的行膀胱尿路上皮癌根治术患者的石蜡标本48例及癌旁正常膀胱组织石蜡标本7例。其中男性45例，女性10例，平均年龄(61.4±7.5)岁。纳入患者临床资料均完整，均经病理学确诊为膀胱尿路上皮癌，术前均未行放疗、免疫因子等治疗。采用WHO(2016)泌尿系统及男性生殖器官分类标准对膀胱尿路上皮癌进行病理学分级[4]：低级别尿路上皮癌15例，高级别尿路上皮癌33例。收集48例膀胱尿路上皮癌患者的临床资料并对患者进行随访。

1.2 方法组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。兔抗人LC3B单克隆、SQSTM1多克隆抗体均购自Abcam公司，工作浓度1 ∶200；苏木精和即用型快捷免疫组化MaxVision法检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。采用MaxVision快速免疫组化法染色。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判读LC3B与SQSTM1免疫反应阳性细胞为黄色或棕色，均定位于细胞质。(1)根据细胞染色强度计分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。(2)根据阳性细胞所占百分比计分：阳性细胞数0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项评分相乘作为最终得分：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，9～12分为()，其中≤4分为低表达，>4分为高表达。

2 结果

2.1 膀胱尿路上皮癌及正常组织中LC3B与SQSTM1的表达免疫组化结果显示，LC3B在膀胱尿路上皮癌组织的阳性率为93.75%(45/48)，在膀胱正常组织中的阳性率为14.28%(1/7)，差异具有统计学意义(χ2=28.187，P<0.01)；SQSTM1在膀胱尿路上皮癌组织中的阳性率为81.25%(39/48)，在膀胱正常组织中的阳性率为0，差异有统计学意义(χ2=31.850，P<0.01，图1)。

图1 LC3B与SQSTM1在不同尿路上皮中的表达，MaxVision法

2.2 膀胱尿路上皮癌中LC3B与SQSTM1表达与临床病理特征的关系膀胱尿路上皮癌组织中，LC3B表达与患者性别、年龄、TNM分期及肿瘤分化程度均无相关性(P均>0.05)；SQSTM1表达与临床分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度显著相关(χ2=13.05，P=0.000 3；χ2=5.035，P=0.025；χ2=11.161，P=0.000 8，表1)。

表1 膀胱尿路上皮癌中LC3B与SQSTM1表达与临床病理特征的相关性

2.3 LC3B、SQSTM1表达与膀胱尿路上皮癌患者生存期的关系采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，分析LC3B、SQSTM1表达与膀胱尿路上皮癌患者预后的关系，结果表明LC3B强阳性组患者的总生存期(overallsurvival, OS)低于弱阳性～中等阳性组患者(χ2=10.05，P=0.001 5)；SQSTM1强阳性患者的OS也低于弱阳性～中等阳性组患者(χ2=11.1，P=0.000 9)。上述结果提示LC3B与SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中强阳性预示患者预后不良(图2)。

图2 LC3B和SQSTM1表达对膀胱尿路上皮癌患者术后5年总生存率的影响：A.LC3B；B.SQSTM1

3 讨论

近年一种新的程序性细胞死亡方式——自噬性程序性细胞死亡，吸引了越来越多细胞生物学家的注意。研究发现，在一些恶性肿瘤细胞中，自噬作为细胞对代谢压力的适应性反应过程，发挥着尤为关键的作用[5]。

哺乳动物中LC3包括LC3A、LC3B和LC3C三种亚型，LC3主要定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬小体的形成，是作为诊断自噬活动的金标准之一[6]。LC3的生物学功能是在自噬发生过程中，LC3蛋白合成后被具有蛋白内切酶活性的Atg4所剪切，生成细胞质定位的LC3-Ⅰ。随后LC3-Ⅰ通过Atg7和Atg3在内的泛素样体系反应，生成LC3-Ⅱ，并定位附着到自噬小体膜上，从而参与细胞自噬的发生[8-9]。LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志物[10]。眭怡群等[11]研究发现，LC3和Beclin 1蛋白高表达胰腺癌患者的预后更差。SQSTM1同样是经典的自噬相关蛋白之一，也称为p62蛋白，可作为支架蛋白参与体内多种信号转导过程，进而在细胞中发挥自噬与凋亡的作用[12]。研究发现SQSTM1可作为反映自噬活性的标记蛋白，SQSTM1通过连接LC3的底物被整合到自噬小体中；当发生细胞自噬时，自噬体与溶酶体相互融合逐渐形成自噬溶酶体后，囊泡内的SQSTM1蛋白或细胞器被溶酶体酶降解，从而引起SQSTM1水平降低；当细胞自噬被抑制时，SQSTM1水平升高[13]。近年来诸多研究表明，自噬与肿瘤的发生发展、侵袭与转移密切相关[14-15]。

本实验结果显示，与正常膀胱黏膜组织相比，膀胱尿路上皮癌组织中LC3B和SQSTM1显著高表达。SQSTM1表达与临床分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度显著相关。说明SQSTM1与膀胱尿路上皮癌的恶性进展密切相关，SQSTM1可能作为癌基因参与了膀胱尿路上皮癌的发生、发展。越来越多的研究表明自噬相关蛋白可作为肿瘤预后的预测分子。Ieni等[16]发现胃腺癌组织中LC3A/B、Beclin 1和Ambra1高表达患者的预后较差，表明自噬相关蛋白可能是晚期胃癌潜在的预测因子。本研究通过Kaplan-Meier生存分析发现，LC3B和SQSTM1高表达组患者的OS均显著低于低表达组患者，提示LC3B与SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中高表达患者的预后不良。

综上所述，LC3B和SQSTM1提示自噬与膀胱尿路上皮癌的预后相关，LC3B和SQSTM1可作为判断膀胱尿路上皮癌临床预后的生物学指标。