LPS及RLX对产后KM小鼠炎性细胞因子的影响

张雪婷，赵雯雯，王风华，吕文憬，张 一，陈建国

(华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070)

子宫复旧指母体在胎盘娩出后子宫在一定时间内逐渐恢复至未孕状态的生理过程，包括子宫体积和重量的减少，肌肉收缩，内膜增生以及血管修复等一系列变化[1]。但由于饲养环境不理想易造成感染，诱发子宫内膜炎或盆腔炎[2-3]，分娩次数过多影响子宫收缩力以及母体年龄和精神状态等原因也常导致子宫复旧不良。子宫复旧不良作为一种常见的产后并发症会影响产后恢复以及下次妊娠，从而影响母体的繁殖力和生产性能，给养殖者带来巨大的经济损失[4-8]。脂多糖(LPS)是导致奶牛子宫内膜炎优势菌革兰阴性菌的主要毒性成分[9]，能够在体外诱导子宫内膜细胞发生炎症反应[10],也可通过进行子宫灌注诱导小鼠发生急性子宫内膜炎[11]。松弛素(RLX)对生殖系统作用主要是抑制妊娠子宫收缩[12],促进胶原降解[13-15]。孕酮和雌二醇在妊娠及分娩中起到重要作用[16]，主要通过调节凋亡相关基因与因子等方式调控子宫内膜细胞的增殖与分化[17-21]。白介素等细胞因子也参与维持子宫内膜的降解与重构[22]，并反映机体的健康状态。本试验旨在通过向子宫灌注LPS和RLX建立2种不同类型的子宫复旧不良模型，比较其与正常子宫复旧的小鼠血清中雌二醇及孕酮的水平以及部分细胞因子的变化，为出现子宫复旧不良的母体产后治疗及药物疗效提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 LPS(Eshcherichiacoli0128∶B8)，购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；RLX，购自武汉优尔生商贸有限公司；速眠新Ⅱ注射液，购自吉林省敦化市动物药品有限公司；雌二醇、孕酮、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白介素1-β(IL-1β)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，均购自NEWA公司。

1.2 主要仪器 多功能酶标仪，PerkinElmer股份有限公司产品。

1.3 实验动物 8周龄SPF级KM小鼠，雌性与雄性，8周龄，体重(35±10)g，均购自辽宁长生生物技术股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 分组及给药 雄鼠与雌鼠以1∶3的比例进行配种，雌鼠确定妊娠后挑出。将刚分娩结束的雌性KM小鼠随机分为3个大组，每组根据灌注次数再随机分为5个小组，分组及给药剂量见表1。

表1 试验小鼠分组及给药剂量Table 1 Grouping and dosage of the experimental mice

LPS组按20 μL/只给予5 mg/mL的LPS溶液；RLX组按2.5 μg/只给予1.25 μg/mL的RLX溶液，24 h内分4次注射，每次注射0.5 mL；PBS组中各小组分为20 μL剂量组和2 mL剂量组，给予PBS缓冲液20 μL(2 mL)/只。按照0、2 d和4 d各灌注1次的规则，隔天进行1次灌注，共灌注5次。

1.4.2 灌注方法 小鼠麻醉处理后，单手提住尾部使其倒立，平口微量进样器抽取20 μL药品，将进样器经阴道伸入宫腔中约0.8 cm，推注灌注液，并倒提小鼠约1 min。

1.4.3 ELISA检测TNF-α、IL-1β含量 收集子宫组织制备成10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min后收集上清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.4 ELISA检测雌二醇、孕酮含量 末次灌注结束后第2天清晨收集各组小鼠血液样品，3 000 r/min离心5 min，分离血清，采用ELISA法检测血清中雌二醇、孕酮含量。

1.4.5 组织学检查 各组小鼠在麻醉、采血及安乐死后，取双侧子宫固定于10%中性甲醛缓冲液中，经组织脱水、透明、包埋、切片并进行H.E.染色，光学显微镜观察并记录。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，采用t检验法比较各组差异，视P<0.05有统计学意义。数据利用Graphpad Prism 5软件进行作图。

2 结果

2.1 LPS和RLX对子宫组织的影响 3个组在子宫体宽度及重量上无明显差异。H.E.染色后镜检结果如图1 所示，与PBS组相比，产后8 d时，LPS组子宫内膜完整度较低，仍有部分内膜上皮细胞未更新，宫腔内容物排出缓慢，同时存在黏膜下出血，子宫腺扩张伴随分泌物偏多，肌层出现炎性细胞浸润等情况。与PBS组相比，RLX组子宫体收缩不全导致恶露等宫腔内容物不能及时排出，另有宫腔容积较大，子宫壁较薄等情况出现。

图1 KM小鼠子宫组织病理学观察 (H.E.染色，400×)Fig.1 Histopathological observation of uterus in KM mice (H.E.staining,400×)A：PBS组0 d; B：LPS组0 d; C：RLX组0 d; D：PBS组4 d; E：LPS组4 d; F：RLX组4 d; G：PBS组8 d; H:LPS组8 d; I：RLX组8 d

根据宫腔内容物、内膜完整度、子宫腺体分泌等情况进行打分，评定子宫复旧情况，具体评定标准见表2。

表2 子宫复旧标准Table 2 Uterine involution standard

各组子宫复旧早期、中期和末期情况见表3。与PBS组相比,LPS组和RLX组在0 d时子宫腺体分泌物稍多。4 d时LPS组子宫内仍有较多内容物，子宫收缩缓慢，子宫腺分泌物较多；RLX组子宫壁较薄，宫腔容积较PBS组更大；且2个组与PBS组相比子宫内膜更新缓慢，内膜完整度更低。8 d时PBS组已基本恢复至未孕水平，子宫复旧完成；LPS组与之相比各方面均恢复较差，RLX组则在子宫内容物排出、子宫体收缩、子宫腺体分泌等方面恢复较差。总体来说LPS和RLX进行子宫灌注均会引起子宫复旧不全，LPS主要诱发炎症反应导致内膜上皮更新迟缓，影响动脉血流；RLX主要导致子宫收缩不全，恶露等内容物排出不及时。

表3 各组子宫复旧评分Table 3 Uterine involution score of each group

2.2 子宫组织中TNF-α与IL-1β的检测与分析 产后不同时间各组KM小鼠子宫组织TNF-α的浓度变化如图2A所示，0～8 d期间，LPS组TNF-α浓度一直显著高于PBS组(P<0.05)，RLX组和PBS组无显著差异(P>0.05)，但RLX组TNF-α浓度随着产后天数增加呈缓慢上升的趋势。产后不同时间各组KM小鼠子宫组织IL-1β的浓度变化如图2B所示，0～8 d期间，RLX组IL-1β浓度一直显著低于PBS组(P<0.05)，LPS组和PBS组无明显差异(P>0.05)。RLX组随时间推移，子宫组织IL-1β浓度略呈下降趋势，其余2个组略有波动，无明显变化趋势。

图2 各组子宫组织炎性因子浓度Fig.2 Inflammatory cytokines concentration in uterine tissue of each group与PBS组相比， *：P<0.05， **：P<0.01； 下图同Compare with PBS group, *：P<0.05， **：P<0.01. The same as below

2.3 血清中雌二醇及孕酮的检测与分析 产后不同时间各组KM小鼠产后血清雌二醇的浓度变化如图3A所示，0～8 d期间，所有组别雌二醇浓度均呈升高趋势。其中0～6 d期间，LPS组与PBS组相比雌二醇极显著升高(P<0.01)，8 d时较PBS组显著提升(P<0.05)。 0～8 d期间，RLX组雌二醇浓度始终极显著高于PBS组(P<0.01)。此外，RLX组的升高趋势较LPS组相比更为明显。产后不同时间各组KM小鼠产后血清孕酮的浓度变化如图3B所示；0～8 d 期间，所有组别孕酮含量均呈上升趋势，产后初期上升较为缓慢，4 d开始孕酮浓度迅速升高且0～4 d期间RLX组孕酮含量显著高于正常组(P<0.05)，后期无明显区别(P>0.05)。

图3 各组血清中雌二醇(E2)及孕酮(PROG)浓度Fig.3 Estradiol and progesterone of serum concentration in each group

3 讨论

当前相关研究多利用未孕小鼠进行子宫内膜炎造模，忽视了自然分娩后母体更容易受环境影响诱发子宫内膜炎的情况，同时因生产等造成肌纤维断裂、肌肉收缩障碍从而导致子宫复旧不全的情况也未得到重视，常单一进行抗生素给药或抗炎治疗[23]。本试验以产后KM小鼠为对象，通过对子宫灌注LPS和RLX建立子宫内膜炎及子宫松弛2种子宫复旧不良模型[24]，并检测TNF-α、IL-1β两种细胞因子以及雌二醇及孕酮的浓度，光镜观察子宫组织形态学变化。结果发现，子宫灌注LPS或RLX后均可导致子宫复旧不良，其中LPS组主要表现为子宫内膜上皮更新不全，炎症导致宫腔内容物排除不及时和子宫腺封闭延迟；RLX组主要表现为子宫收缩减慢，宫腔容积偏大。LPS对TNF-α的分泌具有促进作用，而RLX对IL-1β有明显的抑制作用。雌二醇与孕酮水平均随天数增加而上升，与前期查阅的大部分文献结果一致，即LPS及RLX对雌激素分泌均有促进作用，其中RLX对雌激素分泌的促进作用极为显著(P<0.01)。目前，雌激素是否对子宫修复有促进作用尚未明确，但确定雌激素与孕酮对子宫内膜的增殖与分泌同时进行调控。许多研究证实，雌激素具有抗炎作用[25-26]，本试验中，与PBS组相比，经RLX诱导后产后小鼠血清中雌激素水平极显著提升，其子宫组织中IL-1β含量明显受到抑制，且抑制效果随雌激素含量的水平升高而逐渐明显，证明雌激素能够抑制子宫组织分泌IL-1β，对子宫组织有一定的抗炎作用。此外，有研究表明，雌激素能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的生长[27]，促进子宫内膜的修复与血管新生。本试验中仅RLX组在0～4 d期间孕酮水平与PBS组间存在显著差异(P<0.05)。当孕酮水平较高时子宫收缩受到抑制，胶原被降解，影响恶露排出，有利于细菌繁殖，进一步导致子宫复旧迟缓。由于孕酮与雌激素间存在协同与拮抗作用[28]，结合本试验结果，提示当出现子宫复旧不良时可考虑采用雌激素疗法，不仅能够增强子宫收缩力，促进血管新生，增加结缔组织胶原合成，同时发挥抗炎作用，对由于不同原因导致的子宫复旧迟缓可能均有效，但临床应用时雌激素的具体浓度仍待验证，本试验仅为雌激素治疗多种类型子宫复旧不良提供试验依据。此前有试验证明，在进行单次子宫灌注LPS时，雌激素对IL-1β的表达有抑制作用[29-31]，本试验中LPS为隔天多次灌注且IL-1β水平并未出现明显改变，具体原因尚需进一步分析验证，考虑到LPS诱导子宫内膜炎常呈短时急性反应，而实际生产中部分子宫内膜炎病例可能持续较长时间，故应考虑进行细胞炎性因子鉴定，或配合其他药物进行治疗。