基于网络药理学方法探讨“白术-茯苓”药对抗胃癌的作用机制

李国秋 张嘉雪 陈子铮 陈林耿 吴晓怡 张 韧

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510006

胃癌(Gastric cancer, GC)是中国常见的恶性肿瘤之一，根据2018年2月国家癌症中心发布的最新一期全国癌症统计数据显示，GC的发病率和死亡率分列所有肿瘤类型的第2位与第3位[1]。近年来，GC的发病率呈下降趋势，新型生物制剂的研发和综合治疗策略的不断发展，降低了GC的致死率，但GC的预后仍然不甚乐观。中医在控制癌症病灶发展，延长患者生存期和改善生存质量等方面表现出独特的优势，尤其是中药可提高人体免疫，调节肿瘤微环境的各组分，在肿瘤防治方面具有重要作用[2]。

白术，味苦、甘、微辛，性温，其用在中，主呕逆泄利、去湿强脾、开胃进食、和中益气。《本草通玄》曰：“白术，补脾胃之药，得中宫冲和之气，更无出其右者。土旺则能健运，故不能食者，食停滞者，有痞积者，皆用之也。”现代药理研究[3]发现，白术挥发油具有抗肿瘤、促进胃肠运动、调节胃肠功能、促进营养质吸收的功能。茯苓，味甘，性平，主利水实脾，《神农本草经疏》记载：“中焦者，脾土之所治也。中焦不治故见膈中瘀水，腹胀大也，利水实脾，则其证自退矣。”现代药理研究[4-5]发现，茯苓中的多糖和三萜类成分可保护机体的免疫器官，增强机体免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制胃癌细胞生长，抑制癌细胞转移，清除氧自由基。据目前相关文献报道[6]，“白术-茯苓”药对抗GC的临床疗效显著，但其具体作用机制尚未见系统阐明。

网络药理学是基于系统生物学理论，采用复杂的生物网络模型，从药物、化学成分、靶点、疾病间相互作用的整体性与系统性出发，预测药物治疗疾病的药理学机制的一种方法，其与中医治病的“整体观”理论及中药多成分、多靶点、多途径、多作用的特点具有一致性[7- 8]。故本研究将运用网络药理学方法探讨“白术-茯苓”药对抗GC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 “茯苓-白术”药对药物成分获取 中医药百科全书(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM)是由中国中医科学院中药研究所、中药资源中心、北京大学中药学院等大型单位打造的中医药数据平台，该平台收录了403味中药，7274个中药成分等数据信息，为中医药现代化研究提供了强有力的数据基础和分析平台[9]。

运用ETCM(ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)检索“白术”和“茯苓”两者的药物成分，同时记录各成分对应的“Pubchem ID”和“Canonical SMILES”。

1.2 “茯苓-白术”药对药物成分对应靶点获取 通过Swiss Target Prediction平台(http: //www.swisstargetprediction.ch /) 输入1.1获得化合物成分的的“Canonical SMILES”格式，预测“茯苓-白术”药对药物成分对应的作用靶点。

1.3 “茯苓-白术”药对抗GC的相关靶点收集 在Genecard数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、Pharmgkb数据库(https://www.pharmgkb.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank数据库(https://www.drugbank.ca/)输入“gastric carcinoma”检索GC相关的靶点，删除其中重复的基因。将获得的疾病靶点与1.2获得的成分作用靶点进行比对，最后获得“茯苓-白术”药对抗GC的潜在作用靶点。

1.4 “茯苓-白术”药对抗GC的潜在作用靶点相互作用网络(Protein Protein interaction，PPI)构建 在string数据库(https://string-db.org/)，输入“茯苓-白术”药对抗GC的潜在作用靶点，设置物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“medium confidence”，其余参数保持默认，获取靶蛋白相互作用数据，通过Cytoscape 3.2.1软件构建PPI网络，筛选degree值排名前10的靶点。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1) 对“茯苓-白术”药对抗GC相关靶点进行KEGG通路富集分析，结合P值，从小到大排序，筛选出前10条通路，导出csv文件，对数据进行可视化处理。

2 结果

2.1 “茯苓-白术”药对药物成分收集 通过ETCM数据库，一共获得38个化学成分，其中白术14个、茯苓24个，见表1。

表1 “茯苓-白术”药对药物成分信息

2.2 “茯苓-白术”药对抗GC相关靶点 通过Swiss Target Prediction平台，删除重复靶点后得到69个“茯苓-白术”药对药物成分的作用靶点，接着将这 69个靶点与Genecard、OMIM、Pharmgkb、TTD，和Drug Bank 5个疾病数据库收集到的GC相关基因靶点进行比对，最终得到62个“茯苓-白术”药对抗GC的相关靶蛋白，见表2。

表2 茯苓-白术”药对抗GC的62个靶蛋白

2.3 “茯苓-白术”药对抗GC的潜在作用靶点PPI分析 基于Sring数据库的62个靶蛋白的蛋白质相互作用关系数据，采用Cytoscape 3.2.1软件绘制靶蛋白PPI网络图，如图1所示。此网络共包括57个节点，143条边(若两个靶蛋白之间存在相互作用关系，则用边连接两个靶蛋白)，靶蛋白degree值越大则节点越大。

图1 “茯苓-白术”药对抗GC靶蛋白PPI网络

同时利用Cytoscape 3.2.1软件的筛选工具，筛选出该网络中degree值排名前10 的靶蛋白，分别为TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1。

2.4 KEGG通路富集分析 采用Metascape平台对“茯苓-白术”药对抗GC的62 个作用靶点进行KEGG通路富集分析，筛选前10条目(P值从小到大进行排序)，并且通过Excel对结果进行可视化处理。结果如图2所示。主要通路有Steroid hormone biosynthesis、PPAR signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Arachidonic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Chemical carcinogenesis、Pathways in cancer insulin resistance、Regulation of lipolysis in adipocytes、Leishmaniasis。

图2 “茯苓-白术”药对抗GC的KEGG通路富集分析

3 讨论

3.1 “白术-茯苓”药对抗GC相关的重要药物成分 本研究最终预测得到“白术-茯苓”药对抗GC的38个活性化合物、62个潜在作用靶点及10条通路，其化合物多样性、作用靶点多样性及通路多样性，从药理层面及分子层面论证了中药“同病异治，异病同治”原则。

现代药理研究[10]证实，白术化学成分主要为挥发油、白术多糖、氨基酸等成分，这些化学成分有抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力、抗衰老、调节胃肠等药理作用，茯苓中具有生物活性的化合物主要为三萜类和多糖类化合物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗氧化、抗衰老、增强记忆力、调节泌尿系统、降血糖等[11]。本研究中，白术-茯苓药对筛选出的化合物含多种抗癌成分，如白术内脂I、白术内脂III、茯苓酸等，白术内酯Ⅰ能够抑制MGC-803细胞的生长及繁殖，下调GC细胞表面标志物Hey1、CD44的表达，同时也包括抑制Notch信号通路，及降低Notch1、Hes1、Hey1和Jagged1蛋白的活性，从而有效地抑制GCMGC-803细胞的增殖[12]。茯苓酸能抑制GC细胞的生长和克隆形成能力，显著诱导细胞G2/M期停滞及细胞凋亡，同时调节一些凋亡相关蛋白如caspase-3,PARP, Bcl-2和Bax的蛋白表达，还能扰乱体外GC线粒体能力和抑制体内GC移植瘤生长。

3.2 “白术-茯苓”药对抗GC相关的重要作用靶点 在“白术-茯苓”药对抗GC的PPI网络中，TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1在网络中处于degree值前10名，是“白术-茯苓”药对抗GC的重要潜在靶点。肿瘤坏死因子(TNF)分为两种，分别为TNF-α和TNF-β，国外研究报道，GC患者血清中TNF-α水平明显高于正常人群，手术切除GC组织后患者体内血清中TNF-α水平明显下降，但转移或复发者血清TNF-α水平再度显著升高，该现象提示TNF-α与GC的发生发展密切相关且起到促进作用[13]。毛跃锋等[14]的研究表明参芪扶正汤能明显降低Ⅲ～Ⅳ期GC患者血清中TNF-α、IL-6以及SIL-2R水平，与此同时亦能明显提高患者的免疫功能，提高其生活质量。有研究表明，雄激素受体(AR)在GC组织中高表达，且AR与年龄、性别、肿瘤大小、组织类型等均无明显相关性。调节细胞周期诸多因素的关键角色是cyclinD1，而性激素可通过与其受体结合，介导某些直接或间接机制促进cyclinD1过度表达，从而促进肿瘤细胞增殖，此外性激素经过胃肠道分解和肝内代谢可转变成低浓度的致癌物，与受体结合时可增强其与细胞核内DNA的亲和力，解除对DNA合成的抑制，恢复DNA聚合酶活性，促进细胞增殖，导致细胞恶性增殖的发生。

3.3 “白术-茯苓”药对抗GC相关的重要生物通路 根据KEGG分析结果可知，“白术-茯苓”药对抗GC的信号通路与“癌症途径(pathway in cancer)”最为相关，此外还涉及通路有“类固醇激素合成(Steroid hormone biosynthesis)”“过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路(PPAR signaling pathway)”“神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)”“花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)”“氮代谢(Nitrogen metabolism)”“化学致癌作用(Chemical carcinogenesis)”“胰岛素抵抗(Insulin resistance)”“脂肪细胞中脂肪分解的调节(Regulation of lipolysis in adipocytes)”。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子，在激活状态下参与调节许多与消化道肿瘤形成有关的基因，具有抑制增殖、促进凋亡、抑制细胞周期的进程等抗肿瘤作用，被认为是开发预防治疗GC的重要靶点[15]。张顺荣等[16]研究发现，胃复方含药血浆可通过上调PPARγ基因表达的途径来抑制 SGC-7901 细胞的增殖，促进其凋亡。有研究[17]发现，胰岛素抵抗与GC的患病相关，而GC患者普遍存在糖耐量异常和胰岛素抵抗，这有可能是由于GC本身癌组织通过自分泌和旁分泌途径产生一些生长因子，从而产生和加重一胰岛素抵抗。另有研究[18]认为，高胰岛素血症可加强胰岛素样生长因子(IGF-1)的合成，而IGF-1能够促进细胞有丝分裂，抑制细胞凋亡，促进上皮细胞转化，此外还可促进血管内皮生长，因此增加了细胞恶性增殖的概率，减少肿瘤细胞的凋亡。

4 结论与展望

60%的GC患者手术或化疗后会在2～3年内复发转移，原因在于脱落和逃逸的肿瘤细胞会再次增殖并转移，而化疗药物药物对大多数腺癌缺乏敏感性，常因多药耐药导致治疗失败，或患者因无法耐受化疗药物的毒副反应而中断治疗[19-20]。研究[21]证实，中药治疗GC具有多成分、多靶点、毒副作用小、防止术后复发转移等优点。本研究运用网络药理学方法，筛选出“白术-茯苓”药对潜在活性化合物，获取其治疗GC的潜在作用靶点， 从“成分-靶点-通路”研究药物与疾病之间的相互作用规律，推测“白术-茯苓”药对的药效机理，初步阐释了其治疗GC的作用机制。但由于数据库信息的不全面、化合物的浓度及化合物间的相互作用不明确等因素，使得预测结果有一定的局限性和片面性，需要更多的临床试验与动物实验进一步去验证。