Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

胡荣蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陈益春，刘政，丁希，唐长波，周光宏

Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

胡荣蓉，丁世杰，郭赟，朱浩哲，陈益春，刘政，丁希，唐长波，周光宏

南京农业大学食品科技学院/国家肉品质量安全控制工程技术研究中心/教育部肉品加工与质量控制重点实验室；南京 210095

【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响，为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中，添加不同浓度（0、50、100和200 μmol∙L-1）的Trolox培养3 d，利用血细胞计数板进行细胞计数，统计细胞增殖倍数，同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响；利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的表达水平，Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平；通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用；进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理，利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因、及终末分化标志基因肌球蛋白重链（）的表达水平，并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达，利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示，50和100 μmol∙L-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组（<0.05）；CCK8测得50和100 μmol∙L-1Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组（<0.05）；100和200 μmol∙L-1的Trolox显著上调了的表达（<0.05），对PAX7蛋白的表达有上调趋势，但无显著差异（>0.05）；添加Trolox后，细胞内活性氧水平被极显著降低（<0.001）；在分化进程中添加Trolox后，预分化阶段的和及终末分化阶段的均显著上调（<0.05），而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化（>0.05）；免疫荧光结果显示阳性细胞比例有增多的趋势，但无显著差异（>0.05）。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧，促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。

Trolox；猪肌肉干细胞；活性氧；增殖；分化

0 引言

【研究意义】细胞培养肉技术作为一项高效、环保、可持续的新型肉类生产方式，近年来逐渐成为研究热点[1-3]。目前，肌肉干细胞是培养肉生产中最具有潜力的种子细胞。通过体外分离与培养，肌肉干细胞定向分化形成多核肌细胞，并表达肌肉特有的肌球蛋白重链，形成肌肉纤维组织[4-5]。然而随着培养时间的增加，肌肉干细胞的增殖及分化能力出现明显下降[6-8]，从而影响培养肉的生产效率。【前人研究进展】研究表明，干细胞增殖与分化的过程受信号转导、氧化还原状态及培养环境等因素的影响[9-13]，其中氧化还原状态对干细胞增殖及分化的影响尤为重要[14-15]。细胞内氧化还原状态主要由活性氧的产生及抗氧化系统对其的清除来调控，因此，活性氧水平在一定程度上可以表示细胞内氧化还原状态[16-17]。干细胞退出静息状态进入增殖、分化的进程，主要的代谢方式会发生从糖酵解到氧化磷酸化的转换，同时伴随着活性氧产生的增加[18-19]。然而，过量的活性氧会造成干细胞功能受损，Gu等[20]发现间充质干细胞体外培养积累过量的活性氧导致细胞增殖及分化能力衰退；而L'HONORE等[21]也发现在小鼠的肌肉干细胞体外培养过程中，持续升高的活性氧抑制了细胞增殖，并作为信号分子诱导肌肉干细胞的分化；MALINSKA等[22]在C2C12小鼠肌肉细胞系中也发现活性氧的升高诱导细胞从增殖进入分化进程。Trolox是水溶性维生素E的类似物，其作为一种标准的抗氧化剂，能够减少细胞的氧化损伤，如HORN等[23]研究发现Trolox能够抑制间充质干细胞在氧化应激条件下的凋亡及炎症发生；此外，多数研究表明，Trolox可直接通过调控细胞内的活性氧从而影响细胞的生理功能；例如FROTA JUNIOR等[24]发现Trolox通过降低活性氧提高神经细胞在体外的细胞活力并促进神经突生成。【本研究切入点】前期研究提示活性氧对干细胞增殖及分化的影响因剂量水平及细胞类型等的不同而存在差异[25]；目前活性氧对肌肉干细胞增殖及分化影响的研究主要集中在小鼠肌肉干细胞上，关于猪等畜禽类动物领域的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究通过抗氧化剂—Trolox对猪肌肉干细胞内的活性氧进行调控，研究Trolox对猪肌肉干细胞体外增殖及分化过程的影响，进一步探讨活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化的调控作用，从而为培养肉的规模化生产提供研究基础。

1 材料与方法

试验于2020年在南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心进行。

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物 七日龄幼猪，由苏食集团生猪养殖基地提供。

1.1.2 主要试剂 澳洲胎牛血清、Ham’s F-10营养培养基、bFGF、磷酸盐缓冲溶液（PBS），购于美国GIBCO公司；100×青霉素链霉素双抗、0.25%胰酶，购于上海贝博生物公司；CellROX® Deep Red试剂，购于英潍捷基（上海）贸易有限公司；Trolox，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；RIPA裂解液（强），购于上海碧云天生物技术有限公司；培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，购于天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白质定量试剂盒，购于美国Thermo公司；Trizol总RNA提取试剂，购于英潍捷基（上海）贸易有限公司；TB Green™ Premix Ex Taq™ II、PrimeScript® RT Master Mix Perfect Real Time，均购于日本Takara公司；Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液、免疫印迹PVDF膜，购于南京金斯瑞生物科技有限公司；PAX7一抗（货号：PAX7），购于DSHB公司；MyHC一抗（货号：ab37484），购于Abcam公司；GAPDH一抗（货号：MAB374），购于Millipore公司；鼠二抗（货号：CW2333S），购于Cwbiotech公司；CCK-8 Kit，购于南京木林森生物科技有限公司；免疫荧光鼠二抗（货号：A11005），购于美国Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 猪肌肉干细胞体外短期培养 以七日龄幼猪P5代的肌肉干细胞为研究对象，按照1.5×105个细胞的密度将细胞接种到直径为10 cm且底部铺有胶原的培养皿中，首先在基础培养基中添加重组人成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），生长因子与培养基的添加比例为1﹕2 000；再添加提前通过DMSO配制好的0、50、100和200 mmol∙L-1的Trolox，Trolox与培养基的添加比例为1﹕1 000（Trolox终浓度为0、50、100和200 μmol∙L-1），2 d换一次液。培养3 d后去除原培养基，用4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗去残留的原培养基，然后通过0.25%的胰酶将细胞从培养皿上消化下来，收集细胞后使用血细胞计数板进行细胞计数，并统计细胞增殖倍数。

1.2.2 CCK8检测猪肌肉干细胞增殖情况 将P5代猪肌肉干细胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，试验组培养基含有50、100和200 μmol∙L-1的Trolox，对照组不含Trolox，在37℃、5% CO2的培养箱中分别培养1、2和3 d，每隔24 h，加入10 μL的CCK8试剂，在培养箱中孵育1 h，通过酶标仪测定450 nm处的吸光值。

1.2.3 猪肌肉干细胞内活性氧水平的测定 参照L'honore等[21]的方法，将细胞以1×104/mL接到96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，分别培养1、2、3和4 d，试验组培养基含有100 μmol∙L-1的Trolox，对照组不含Trolox；然后进行CellROX染色；CellROX染色具体操作步骤为：吸去细胞原培养基，更换添加含有CellROX Deep Red试剂的新鲜培养基，CellROX Deep Red试剂与培养基的配制比为1﹕500；将细胞放置在37℃的二氧化碳培养箱孵育30 min；吸去培养基，PBS清洗3次，更换添加含有Hoechst试剂的新鲜培养基，Hoechst与培养基的配制比为1﹕1 000；将细胞置于37℃的二氧化碳培养箱孵育5 min；吸去培养基，PBS清洗3次；添加100 μL新鲜培养基覆盖细胞，在活细胞状态下进行高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测。

1.2.4 RT-qPCR检测相关基因的表达量 收集状态良好的细胞，加入Trizol试剂裂解细胞，抽提细胞总RNA；按照天根RNA试剂盒的操作技术说明书提取RNA，超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度；通过TAKARA的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII试剂盒进行PCR反应测定，按照操作技术说明书展开操作，RT-qPCR标准程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，循环40次，然后绘制曲线。使用2-△△CT的方法计算目的基因在不同cDNA模板中的相对表达量。

1.2.5 Western blotting检测相关蛋白的表达 使用RIPA裂解细胞并提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白的浓度；加入Loading Buffer在95℃下进行蛋白变性；取适量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），电泳结束后进行转印，转印结束后蛋白转移至PVDF膜，封闭1.5 h；4℃下孵育一抗14—16 h（PAX7终浓度为0.5 μg∙mL-1，MyHC的稀释比例为1﹕1 000）、二抗孵育2 h（稀释比例为1﹕2 000）；显影拍照；使用Quantity one软件进行蛋白条带的灰度值分析。

1.2.6 免疫荧光鉴定肌管的形成 细胞分化结束后吸去分化培养基，PBS清洗1遍，用4%多聚甲醛（PFA）固定，并在4℃下过夜；然后用0.5% Triton X-100通透30 min，PBS清洗3遍；加入一抗（MyHC的稀释比为1﹕800）在4℃下孵育过夜，PBS清洗3遍；然后加入二抗（稀释比例为1﹕500）在室温下孵育1 h，PBS清洗3遍；滴加含DAPI的防荧光猝灭剂，盖上合适的盖玻片，在玻片周围滴加指甲油封片，在共聚焦显微镜下观察采集图像。

1.3 统计分析

应用GraphPAD Prism 8.0软件进行数据统计分析，采用One-way ANOVA、检验方法对数据进行显著性差异分析。每组试验均设置3个生物学重复，所有数据均以“平均数±标准差”表示；每个生物学重复至少采集3个技术重复或视野。

表1 RT-qPCR引物信息

2 结果

2.1 猪肌肉干细胞体外短期培养的形态学观察

倒置显微镜下观察短期培养1、2和3 d的猪肌肉干细胞，培养1 d的细胞主要发生贴壁过程，细胞数量少、体积小，细胞形态呈球形或偏梭形；随着培养天数的增加，细胞数量增多，细胞体积开始变大且形态趋于稳定，主要呈长梭形或者纺锤形，呈典型肌肉干细胞形态（图1）。

2.2 Trolox对猪肌肉干细胞体外增殖的影响

从倒置显微镜观察，Trolox处理组的细胞数目较对照组更多，细胞体积略小（图2-A—D）。细胞增殖倍数统计显示（图2-E），较对照组，50、100和200 μmol∙L-1的Trolox处理组分别增殖了1.26倍、1.22倍、1.07倍，其中50和100 μmol∙L-1的Trolox处理组细胞增殖倍数显著高于对照组（<0.05）。进一步通过CCK8法检测Trolox对细胞增殖的影响，结果显示（图2-F），50和100 μmol∙L-1的Trolox处理组3 d的吸光值显著高于对照组（<0.05）。综上，Trolox对猪肌肉干细胞的增殖具有促进作用，且适宜的促增殖浓度为50和100 μmol∙L-1。

A—C：培养1、2、3 d的猪肌肉干细胞（50×）；D—F：培养1、2、3 d的猪肌肉干细胞（200×）

A—D：分别为0、50、100和200 μmol∙L-1的Trolox培养3 d后的猪肌肉干细胞（50×）；E：不同浓度的Trolox培养3 d后猪肌肉干细胞的增殖倍数；F：CCK8法检测不同浓度的Trolox培养1、2和3 d猪肌肉干细胞的增殖情况

2.3 Trolox对猪肌肉干细胞内活性氧的调控

检测Trolox对细胞内活性氧的影响，探究Trolox是否通过发挥其抗氧化特性—降低活性氧[26-27]，从而促进猪肌肉干细胞的增殖。通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧染色以及高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统的检测结果显示，在猪肌肉干细胞短期培养过程中（1—3 d为正常短期增殖时期，第4天为细胞增殖至长满培养皿，即预备分化的阶段），Trolox处理组单个细胞CellROX染色的单位面积平均荧光强度（图3-C）、荧光染色面积（图3-D）显著低于对照组（<0.05），最后通过计算每个细胞CellROX染色的总荧光强度，显示Trolox处理组每个细胞CellROX染色的总荧光强度被极显著降低（图3-E）（<0.001），表明Trolox处理后，细胞内的活性氧被显著降低。以上结果进一步表明降低体外培养过程中猪肌肉干细胞内的活性氧能够促进其增殖，说明活性氧对猪肌肉干细胞的增殖具有一定的抑制作用。

2.4 Trolox对猪肌肉干细胞干性基因PAX7的影响

培养肉的生产需要在体外获得大量的肌肉干细胞，同时要求其具有较高的分化潜能，肌肉干细胞的增殖能力以及分化潜能表征着其“干性”，PAX7是衡量肌肉干细胞体外培养干性水平的重要指标[28-29]。RT-qPCR以及蛋白免疫印迹技术对PAX7的检测结果显示，在转录水平（图4-A），Trolox处理组的表达量随Trolox浓度升高而升高，其中100和200 μmol∙L-1的Trolox处理组的表达量分别显著上调了65%（<0.05）和111.6%（<0.01）；而100和200 μmol∙L-1的Trolox处理组PAX7蛋白的表达量较对照组有上调的趋势，但无显著差异（图4-B）。结果表明Trolox在一定程度上能够维持猪肌肉干细胞体外培养的干性。

图4 不同浓度的Trolox对PAX7的影响

2.5 Trolox对猪肌肉干细胞分化的影响

体外培养猪肌肉干细胞（图5-A），使其增殖4 d至细胞长满培养皿、细胞汇合度达到90%时为肌肉干细胞的预分化阶段（图5-B），随即更换分化培养基，诱导细胞分化5 d，至70%的细胞融合形成多核肌管，即终末分化结束（图5-C）。

选用对猪肌肉干细胞促增殖作用及对干性基因上调作用较明显的100 μmol∙L-1Trolox进行分化进程试验。是早期标志生肌分化调控因子，能够推进肌肉干细胞肌源性分化进程并启动肌源性祖细胞的终末分化[30]；是标志肌细胞融合的基因，其表达量随着肌细胞融合数量的增加而增加[31]。通过RT-qPCR技术对预分化阶段和表达的检测结果显示（图5-D—E），Trolox处理组、的表达显著上调，较对照组分别显著上调145.7%、87.4%（<0.05）。

肌球蛋白重链标志着肌肉干细胞终末分化阶段多核肌管的形成，通过RT-qPCR以及蛋白免疫印迹技术对的检测结果显示，在转录水平（图5-F），无论是在增殖时期还是进入分化的过程添加Trolox，对的表达都有显著上调作用，其中在增殖及分化两个过程都添加Trolox的处理组上调最显著，较对照组显著上调了81.5%（=0.0003），而只在增殖阶段以及只在分化阶段添加Trolox的处理组分别显著上调33.1%（<0.01）、31.0%（<0.05）；然而在翻译水平（图5-G），与对照组相比，Trolox对MyHC蛋白的表达无显著影响；通过免疫荧光技术对肌管进行染色（图5-H—K），统计肌管中的细胞核占样品中总细胞核的比例，其可以表征肌细胞融合指数[6]，统计结果显示（图5-L），Trolox处理后，MyHC阳性细胞比例有增多的趋势，但无显著差异。以上结果表明，Trolox能够促进猪肌肉干细胞的分化进程。

3 讨论

迄今为止，肌肉干细胞对肌肉再生及肥大的贡献已被大量研究证实，肌肉干细胞从静息状态被激活，在体外进行增殖、分化的过程很好地模拟了肌肉纤维组织的发育途径，因此，近年来，肌肉干细胞又被作为最具有潜力的种子细胞用于培养肉技术的研究。活性氧是调节细胞内氧化还原状态的主要氧化活性物质，参与调控干细胞的增殖及分化过程。研究表明，降低体外培养的干细胞活性氧水平，有助于干细胞的体外扩增；例如BAI等[32]通过使用可降解的两性离子水凝胶构建体外3D培养环境帮助造血干细胞维持细胞内较低的活性氧水平，从而显著提高了细胞的扩增能力；此外，还可以通过添加抗氧化物质来调控细胞内的活性氧。唐朝春[33]通过使用多酚类抗氧化物质—白藜芦醇促进了造血干细胞的体外增殖；在肌肉干细胞的研究中，L'HONORE等[21]通过抗氧化剂—N-乙酰半胱氨酸（NAC）或Trolox处理降低小鼠肌肉干细胞内的活性氧来改善细胞增殖能力的衰退；GARCÍA- PRAT等[26]同样通过使用Trolox抑制细胞内过高的活性氧从而恢复老年小鼠肌肉干细胞的功能特性并增强其用于肌肉组织的修复能力。本研究结果表明Trolox降低增殖过程中细胞内的活性氧水平，促进了猪肌肉干细胞增殖，与L'HONORE等[21]和GARCÍA-PRAT等[26]的研究结果相似。本研究结果进一步表明，猪肌肉干细胞在体外培养过程中，细胞内的活性氧对其增殖具有一定的抑制作用。活性氧对干细胞增殖的抑制作用可能是通过对细胞内功能性的生物大分子如DNA、RNA、蛋白质等进行了氧化修饰。活性氧引起的氧化修饰可以分为两方面，一方面通过氧化修饰直接或间接地激活某些信号通路从而改变细胞命运，例如在小鼠肌肉干细胞中，活性氧通过氧化磷酸化激活P38 MAPK信号通路，促使其退出细胞周期，提前进入分化进程[21]；另一方面是造成细胞损伤，例如DNA或RNA链的断裂，以及蛋白质氧化造成蛋白质结构发生变化甚至使其失去活性，从而导致细胞功能受损、衰退，如氧化后的肌肉干细胞会发生DNA损伤以及不可逆性衰老[26]，在间充质干细胞长期培养过程中也发现由于活性氧的累积造成细胞周期停滞并且促使细胞衰老、凋亡[20]。关于猪肌肉干细胞体外短期培养过程中，活性氧对其增殖的具体调控机制有待进一步研究。

肌肉干细胞的干性主要表现为其增殖能力及分化潜能，PAX7是肌肉干细胞的特异性核转录因子，也是目前公认的衡量肌肉干细胞干性的标志物。有研究表明，PAX7通过抑制初级分化基因的表达以及诱导有丝分裂的一部分肌肉干细胞回到静息状态来维持干性；抑制PAX7的表达，肌肉干细胞则无法维持干细胞池且只能走向分化[34]。在体外培养过程中，高表达7的肌肉干细胞被赋予高水平的干性，它们在体外可持续增殖并具备分化成多核肌管的潜能。本研究中，Trolox能够显著上调的表达，且在翻译水平对PAX7蛋白的表达也有上调趋势，表明Trolox在一定程度上能够维持猪肌肉干细胞体外培养的干性，与L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干细胞中的研究结果类似，这可能与活性氧参与调控肌肉干细胞干性相关的信号通路有关。例如有研究表明，达到一定水平的活性氧可以激活P38 MAPK通路，而P38α信号通路在肌肉干细胞从增殖到分化的进程中起非常重要的作用[35-36]，激活的p38α信号通路可以通过上调JNK磷酸酶MKT-1关闭JNK促增殖通路导致细胞周期蛋白Cyclin D1的下调，从而诱导细胞退出细胞周期[37]；此外，p38α信号通路还可以通过磷酸化Ezh2促进YY1和PRC2之间的相互作用，在PAX7启动子上形成抑制性染色质，从而下调肌肉干细胞中的表达[38-39]；因此，推测抗氧化剂Trolox可能是通过降低活性氧，抑制了P38 α等信号通路的活化，从而维持肌肉干细胞的干性。

MALINSKA等[22]发现小鼠C2C12肌肉细胞系在分化开始前活性氧剧烈升高；L'HONORE等[21]通过抗氧化剂抑制小鼠肌肉干细胞预分化时期的活性氧，阻止了细胞进入分化进程。这些研究表明，达到一定水平的活性氧是诱导肌肉干细胞分化的信号分子。本研究发现，在猪肌肉干细胞体外短期培养过程中，活性氧水平随培养时间的增加逐渐下降，且在预分化阶段活性氧水平未出现升高的现象；同时，通过在猪肌肉干细胞分化进程中添加抗氧化剂Trolox处理后发现，分化早期标志基因和、终末分化的标志基因都显著上调，并且免疫荧光结果显示阳性细胞比例增大，表明抗氧化剂Trolox能够促进猪肌肉干细胞的分化进程；这与MALINSKA等[22]和L'HONORE等[21]在小鼠肌肉干细胞中的研究结果相反，可能是因为来源于不同类型的动物肌肉干细胞在体外培养过程存在生物学差异。此外，本研究中Trolox显著上调的表达，而对MyHC蛋白的表达没有显著影响，并且同样的现象也出现在对的检测结果中，推测可能与mRNA在合成蛋白前后受到转录及翻译后调控的过程有关，mRNA在翻译成蛋白之前需要经历一系列转录后修饰和加工等过程，且真核生物的转录以及翻译过程存在时间和空间上的有序性[40]，可能会导致蛋白的合成滞后；另外，蛋白合成之后同样受到翻译后调控的过程，当蛋白稳定性不好时，在细胞内的更新速度加快，多合成出来的蛋白很快会被降解[41]，因此也可能导致蛋白的变化未能被检测出来。根据本研究结果，推测猪肌肉干细胞在体外培养过程中细胞内的活性氧对其成肌分化的过程可能存在负调控作用。活性氧对肌肉干细胞成肌分化的负调控作用可以通过激活某些信号通路从而导致肌源性分化的转录因子下调，例如目前研究较多的NF-κB信号通路被认为与骨骼肌分化的负调控直接相关；ARDITE等[42]和GUTTRIDGE等[43]通过外源性氧化应激导致小鼠肌肉干细胞内活性氧升高，升高的活性氧激活NF-κB信号通路，从而直接下调肌源性生肌分化因子的表达，的下调进一步会抑制成肌调节因子和的表达，最终造成成肌分化受损。另有研究表明NF-κB信号通路还可以通过激活细胞周期蛋白cyclin D1促进有丝分裂阻止肌肉干细胞进入分化进程[44]。此外，当活性氧处于异常高水平时，对细胞造成的氧化损伤也会导致肌肉干细胞分化能力的降低，例如在体外突变胚胎肌细胞中氧化还原控制的核心调节因子Pitx2/3，造成调节线粒体功能的核呼吸因子下调，从而引起产生的活性氧剧烈升高，过量的活性氧导致成肌细胞DNA氧化损伤的积累以及成肌分化细胞的凋亡[45]。以上所述研究均是在细胞受到氧化应激的情况下进行的，而本研究中猪肌肉干细胞处于正常生理状态，未来可以通过建立猪肌肉干细胞的氧化模型来探究活性氧对细胞分化的具体调控机制。

4 结论

抗氧化剂Trolox可通过降低细胞内的活性氧水平促进猪肌肉干细胞的增殖以及成肌分化进程，且能够维持细胞的干性；研究结果为未来通过调控活性氧优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化的过程提供一定的理论基础。

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Effects of Trolox on Proliferation and Differentiation of Pig Muscle Stem Cells

Hu RongRong, Ding ShiJie, Guo Yun, ZHU HaoZhe, CHEN YiChun, LIU Zheng, DING Xi, TANG ChangBo, ZHOU GuangHong

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/National Meat Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing 210095

【Objective】The objective of this study was to investigate the regulatory effects of Trolox, an antioxidant water-soluble vitamin E analogue, on the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells, which possibly was affected by reactive oxygen species. The study could provide a theoretical fundament for further optimizing the proliferation and differentiation process of cultured meat seed cells.【Method】Initially, 0, 50, 100 and 200 μmol·L-1of Trolox was added to pig muscle stem cells during their proliferation culture for 3 d, respectively. The blood cell counter and CCK8 technology were both used to detect the influence of Trolox on the cell proliferation. RT-qPCR was employed to measure the expression level of PAX7 gene for the further characterizing cellular stemness induced by Trolox. Meanwhile, Western Blotting was also used to testify the expression level of PAX7 protein. The intracellular reactive oxygen species was stained by CellROX fluorescent dye, and the High-throughput High-content Live Cell Confocal Imaging System was adopted to evidence the regulatory effect of Trolox on reactive oxygen species. Trolox was additionally used to themyogenic differentiation of pig muscle stem cells. RT-qPCR was used to detect the expression levels of early differentiation marker genes,and terminal differentiation marker gene myosin heavy chain (). Western Blotting was applied to detect the expression of MyHC protein, whereas Immunofluorescence technique stained MyHC and counted the proportion of MyHC positive cells.【Result】The cell proliferation fold statistics indicated that the proliferation fold of pig muscle stem cells in 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups was significantly higher than that under the control group (<0.05); CCK8 test showed that the absorbance value under 50 or 100 μmol·L-1Trolox treatment groups on the 3rd day was significantly higher than that under the controls (<0.05); Trolox concentrations at 100 or 200 μmol·L-1significantly up-regulated the expression of PAX7 gene (<0.05), but had no dominant effect for the improvement of PAX7 proteins with no statistical difference (>0.05). The level of reactive oxygen species in the cells was significantly reduced (<0.001) when Trolox applied. Moreover, after the addition of Trolox to the cells in their differentiation process, MYOG and CAV-3 in the predifferentiation stage as well as MyHC genes in the terminal differentiation stage were dramatically up-regulated (<0.05). However, Western Blotting results exhibited that the expression of MyHC protein had no a huge change (>0.05), while the immunofluorescence results displayed that the proportion of MyHC positive cells had an increasing trend but there was no statistical difference (>0.05).【Conclusion】Trolox promoted the proliferation and differentiation of pig muscle stem cells via reducing reactive oxygen species in the cells.

Trolox; pig muscle stem cells; reactive oxygen species; proliferation; differentiation

2021-05-20；

2021-07-31

国家自然科学基金青年项目（31501509）、国家重点研发计划政府间国际科技创新合作项目（2019YFE0103800）、江苏省优势学科建设项目青年创新基金（80900604）

胡荣蓉，E-mail：1119776527@qq.com。丁世杰，E-mail：shijieding@njau.edu.cn。胡荣蓉与丁世杰为同等贡献作者。通信作者唐长波，E-mail：changbotang@hotmail.com。通信作者周光宏，E-mail：guanghong.zhou@hotmail.com

（责任编辑 赵伶俐）