基于16S rRNA基因测序分析不同喂养方式对食物过敏婴幼儿肠道微生态的影响*

王 晶,黄丽英,陆俊佳,余 夏

(广西医科大学第三附属医院/南宁市第二人民医院，南宁 530031)

食物过敏(food allergy，FA)的发生率目前逐年上升，有资料显示8%的儿童、近5%的成年人存在FA[1]。虽然部分婴幼儿的FA可随年龄增长而自愈，但MIYAJI等[2]认为婴幼儿期FA可能会成为严重过敏性疾病的重要诱因或加重因素。同时婴幼儿因FA所致的优质蛋白、微量元素等物质摄入不足继发的健康问题也时有报道[3]。有学者发现肠道菌群结构、机体肠道黏膜免疫功能和过敏反应密切相关，认为肠道微生态是引起FA的主要原因[4]。本研究应用Illumina第2代高通量测序技术研究不同喂养方式的FA婴幼儿肠道菌群的差异，分析不同喂养方式对婴幼儿肠道微生态的影响，以期为婴幼儿FA的预防及治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2019年3-10月于南宁市第二人民医院初诊为FA的婴幼儿(n=44)，根据喂养方式的不同分为3组，纯母乳喂养组:出生6个月内除母乳外，不给予配方奶或其他食物(糖水、维生素和钙除外)；人工喂养组:出生后完全配方奶喂养；混合喂养组：出生6个月内除母乳外，给予配方奶补充喂养。选取同期进行健康体检的健康婴幼儿12 名作为对照组，4组研究对象性别、年龄、胎龄、出生体重、生产方式等差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 研究对象基本情况

FA婴幼儿纳入标准：(1)临床诊断为FA；(2)年龄0～24个月；(3)无糖尿病、肥胖及其他代谢疾病；(4)无感染性疾病；(5)征得患儿监护人同意，并签署知情同意书。

所有研究对象均通过问诊获得胎次、产次、胎龄、家族性过敏史、遗传性疾病史等基本信息，且在粪便采集前1个月未使用抗生素、益生菌、益生元等。本研究经本院医学伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1标本采集

采集研究对象新鲜成形大便的中段大便10 g，放入无菌采集盒后，1 h内置于-80 ℃保存，用于后期肠道微生物总DNA提取。

1.2.2微生物总DNA的提取和检测

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)提取研究对象粪便中微生物总DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的纯度和完整性，并对DNA进行定量。

1.2.3微生物DNA文库的构建

经过检测的DNA被超声波破碎仪随机打断成长度约为350 bp的片段，用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4 PNK将打断形成的黏性末端修复成平末端，并在3′端加碱基“A”，使DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接后，以目的DNA为模板，在含有测序接头的融合引物引导下，进行融合引物聚合酶链反应后，磁珠筛选纯化目的扩增片段。最后，用合格的文库进行集群制备和测序。

1.2.4测序

应用Illumina平台(Miseq)进行测序。

1.3 数据分析

样本经过测序可得到大量序列，应用 mothur 软件进一步处理，将相似度大于或等于97%的序列聚类形成1个临时操作单元(operational taxonomic unit，OTU )，得到多个OTU。OTU一方面可用于计算样本的Alpha 多样性(chao1值、ACE值、Shannon指数等)，并判断样本物种的多样性。另一方面 OTU注释可明确样本的物种组成和分类分项，在最佳分类水平上分析各研究对象物种组成的相似性。同时对样本做主成分分析(PCA)，找出对造成样本间差异贡献较大的物种。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 研究对象肠道微生态样本物种丰度及Alpha 多样性的比较

4组研究对象粪便中的物种丰度(OTU数量)和多样性指数均以母乳喂养组最低，其次是对照组，最高的是人工喂养组。4组间OTU数量存在明显差异(P<0.05)。组间进一步比较，母乳喂养组和对照组的平均OTU数量明显少于混合喂养组和人工喂养组，差异有统计学意义(P<0.05)。但母乳喂养组较对照组、混合喂养组较人工喂养组的平均OTU数量虽略有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)。4组间Alpha 多样性指数略有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 研究对象样本的物种丰度及Alpha多样性

2.2 4组研究对象的肠道菌群结构

2.2.1FA婴幼儿和健康婴幼儿在肠道菌群分级门(Phylum)水平的分布比较

对研究对象的粪便进行微生物16S rRNA基因V3区测序，共检测到12个菌门，相对丰度较高者为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)等5个菌门。进一步物种差异分析，厚壁菌门在研究对象中均有较高的相对丰度，但与对照组比较，FA婴幼儿的厚壁菌门相对丰度更高。 拟杆菌门、放线菌门和梭杆菌门在4组间呈现明显差异，拟杆菌门、梭杆菌门在母乳喂养组(28.5%和7.9%)和对照组(44.7%和13.7%)的相对丰度较人工喂养组(7.5%和0.6%)和混合喂养组(14.1%和0.5%)显著增加。而放线菌门在人工喂养组和混合喂养组(19.2%和23.4%)的相对丰度较母乳喂养组(3.1%)和对照组明显增加(1.0%)。从门分类水平物种注释图中可看出样本之间也有明显的个体差异，拟杆菌门在混合喂养组中的丰度可从3.2%上升到 38.6%；而放线菌门在混合喂养组各样本中的比例也是从1.2%上升到42.8%，见图1。

H001、H002：母乳喂养组；H003、H004：对照组；P001、P002、P003：混合喂养组；P004、P005、P006、P007：人工喂养组。图1 4组研究对象肠道微生物菌群门水平的组成

2.2.2FA婴幼儿和健康婴幼儿在肠道菌群分级科(Family)水平的分布比较

物种注释显示最佳的分类水平为科，每个样本均有98%以上的序列在该水平上得到分类。在科水平上，笔者对各样本中丰度≥0.5%的科进行了统计。研究对象粪便样本中相对丰度较高的科共检测到24个(图2)。母乳喂养组和对照组以螺旋菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)为优势菌，而人工喂养组和混合喂养组主要以螺旋菌科、瘤胃菌科(Rumioncoccaceae)为优势菌。4组物种构成呈现多样化，但4组间物种多样性并未显著差异。对所有样本进行聚类分析发现，人工喂养组、混合喂养组和母乳喂养组、对照组的相似度很低，表明4组样本菌群差异较大。进一步两两分析显示，母乳喂养组、对照组的相似度较高，而人工喂养组和混合喂养组的相似度亦较高。PCA分析发现造成4组之间差异贡献最大的类群为瘤胃菌科、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和拟杆菌科。瘤胃菌科在对照组(3.4%)中相对丰度明显低于母乳喂养组(13.3%)、混合组喂养组(23.6%)和人工喂养组(28.8%)。而拟杆菌科在对照组中(31.1%)的相对丰度却明显高于母乳喂养组(23.16%)、混合喂养组(8.16%)和人工喂养组(4.48%)。另外PCA分析还发现与母乳喂养组相似度较高的混合喂养组样本中拟杆菌科相对丰度较高，而与人工喂养组相似的样本中瘤胃菌科含量较高，见图2。

H001、H002：母乳喂养组；H003、H004：对照组；P001、P002、P003：混合喂养组；P004、P005、P006、P007：人工喂养组。图2 4组研究对象肠道微生物菌群科水平的组成

3 讨 论

肠道微生态是指寄生于肠道的微生物与宿主之间相互作用、相互影响的共生关系统一体。有学者认为肠道定植的大量微生物是人类基因组信息的重要补充，与人体健康密切相关[5]。国内外研究亦表明肠道微生物群落的紊乱，将影响机体的免疫、代谢、神经、内分泌等系统，是诱发自身免疫性疾病、糖尿病、自闭症、抑郁症和癌症等多种疾病的重要因素之一[6-7]。婴幼儿时期是宿主肠道菌群建立的关键时期，而喂养方式是影响婴幼儿肠道微生态的重要因素，它通过影响婴儿肠道菌群的定植，进而影响肠道微生态的稳定性[8]。国内研究亦表明喂养方式与婴儿腹泻、过敏性疾病等有关系[9]。因此研究不同喂养方式所引起食物过敏的作用机制具有非常重要的临床意义。早期对肠道微生态的研究主要采用传统培养技术，但该方法具有局限性，只能检测培养型的微生物，而培养型的细菌在肠道菌群中仅为1%～10%，与机体相互作用的非培养型菌群严重漏检[10]。随着核酸测序技术的发展和测序成本的降低，通量高、测序快、准确度高的高通量测序技术被广泛应用在微生物的研究中，肠道微生态的研究亦逐渐使用该技术[11]，它几乎可以检测出粪便中所有菌群，对肠道微生物的构成有更全面、更深入的认识，对肠道病理学的研究具有巨大的促进作用。

本研究的结果显示所有粪便样本OTU数量最多可达到423，最少为126。OTU的数量代表样本物种的丰度，表明研究对象粪便样本中的微生物丰度很高，但样本之间微生物丰度差异较大，母乳喂养组的平均OTU数量最少，其次为对照组，人工组最高。母乳喂养组和对照组的平均OTU明显低于人工喂养组和混合喂养组，这与李在玲等[12]的研究结论一致，而母乳喂养的FA婴幼儿的肠道细菌丰度较对照组无明显差异，这提示健康婴幼儿和母乳喂养的FA婴幼儿维持肠道正常功能、代谢及抵御病原菌方面的肠道细菌丰度要低于人工喂养和混合喂养的FA婴幼儿，进一步说明FA的发生、发展不仅可能与肠道定植的细菌丰度有关，还与遗传因素有关。有学者认为微生物的构成多样性，对宿主的表型有着重要的影响[13]。但本研究中4组间肠道菌群的Alpha 多样性指数差异无统计学意义，说明菌群的相对丰度在宿主的表型中起到更加重要的作用。

本研究发现厚壁菌门是所有研究对象粪便样本中的优势菌，与FU等[14]的研究结果一致,厚壁菌门在宿主肠道上皮细胞供能和发育起到重要作用，当厚壁菌门的丰度减少，将引起机体糖类代谢异常。4组间肠道菌群结构差异主要在于拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门。拟杆菌门和梭杆菌门在母乳喂养组和健康婴幼儿中的相对丰度较人工喂养组和混合喂养组高。拟杆菌门主要定植在肠黏膜表面，能抵御肠侵入性病原菌的黏附，为有益菌群。而梭杆菌门的梭杆菌已被证实可以抑制调节T细胞的增生，从而抑制组织的炎症反应[14]。而人工喂养组和混合喂养组的放线菌门较母乳喂养组和对照组明显增加。有学者发现放线菌门通过微生物的磷酸转移酶系统能影响机体糖、脂、蛋白质代谢相关[15]。这可能是FA婴幼儿容易营养不良的主要原因。

进一步分析肠道菌群结构，发现螺旋菌科是研究对象中的优势菌，但健康婴幼儿的相对丰度明显低于FA婴幼儿，这可能是婴幼儿发生FA的原因之一。对所有样本进行聚类分析显示人工喂养组、混合喂养组、母乳喂养组、对照组的相似度很低。进一步两两分析发现母乳喂养组与对照组、人工喂养组与混合喂养组的相似度较高，提示人工喂养和混合喂养的婴幼儿发生FA的原因可能与肠道菌群结构有关，而母亲喂养的婴幼儿发生FA的原因更倾向于遗传因素。PCA分析发现导致4组之间差异贡献最大的菌群为瘤胃菌科、双歧杆菌科和拟杆菌科。瘤胃菌科在对照组中相对丰度明显低于FA婴幼儿，而拟杆菌科在健康婴幼儿中的相对丰度却明显高于FA婴幼儿。而研究已发现拟杆菌主要定植在肠黏膜表面，拮抗侵入性病原菌的黏附肠上皮细胞，是有益菌群[15]。同时PCA分析发现混合喂养婴幼儿间的菌群结构差异与喂养情况有关，与母乳喂养较高的混合喂养组样本中拟杆菌科相对丰度较高，而配方奶喂养较高的样本中瘤胃菌科含量较高。

综上所述，母乳喂养的FA婴幼儿与健康婴幼儿肠道微生态相似，而人工喂养和混合喂养的FA婴幼儿肠道菌群结构和丰度与健康婴幼儿存在差异，提示FA的发生、发展可能跟喂养方式不同所致的肠道微生态的改变有关。