基于羧基化碳纳米管检测磺酰胺的电化学传感方法研究

曾一芳，邱道扬，陈丽丽，赵 利，文阳平，汤凯洁*

（1.江西科技师范大学 生命科学学院，江西 南昌 330013；2.江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；3.江西农业大学 功能材料与农业应用化学研究所，江西 南昌 330045）

【研究意义】磺胺类（Sulfonamides，SAs）抗生素是一类广谱抗菌药物的总称，在临床上常被用于预防和治疗革兰氏阳性菌或阴性菌感染的疾病，被广泛应用于医疗、畜牧和水产养殖行业中预防和治疗疾病[1]。对氨基苯磺酰胺（Sulfanilamide，SA），简称磺酰胺，是磺胺类药物中结构最简单的一种，也是其他磺胺衍生物的母体结构。有报道SAs 在食品中的残留对消费者健康具有潜在的风险，可能会引起过敏反应、诱导人体产生耐药性、损害泌尿系统、降低人体免疫力、严重的甚至会抑制白细胞合成或诱发癌症风险等[2]。【前人研究进展】有研究表明水中的磺胺类溶度在0.15～0.30 mg/dm3可以改变鲤鱼血浆中蛋白质图谱[3]。随着SAs 药物在养殖业中被广泛使用，加之养殖户法律意识淡薄以及趋利心理，常有不遵守休药期或擅自加大用药量行为的发生，导致SAs 药物在食品中的残留问题日趋严重。从福建养殖的草鱼、罗非鱼和鳗鱼中36 种抗生素的残留检测结果分析，磺胺嘧啶含量高达161.2 μg/kg[4]，超过国家安全限量标准（100 μg/kg）。埃及的Kırkan 等[5]报道了13 个蜂蜜样品中有4 个样品为阳性。越南的Yen等[6]报道了40 个虾样品中有22.5%检出抗生素残留，包括SAs 的残留。加拿大的Dinh 等[7]报道了56 个海产品中SAs 的检出率为11%，可见SAs 在食品中的残留是全球性的问题，应该引起各国监管部门高度重视。目前检测磺胺类药物的常见方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8]、液相色谱-质谱联用（liquid chromatography mass spectrometer，LC-MS）法[9]、免疫分析法[10]、毛细管电泳法[11]等。HPLC 和LC-MS 法检测SAs 不仅定性定量准确，而且可以实现多残留同时检测，是目前实验室最常用的一种方法。

【本研究切入点】但是采用HPLC，LC-MS方法，样品一般都需要经过多步液液萃取、净化柱净化和富集等操作。这些预处理不仅步骤繁琐、耗时，而且消耗多种有机试剂，污染环境和对操作人员的健康造成潜在危害；另外这些大型仪器比较昂贵，且需要熟练的专业技术人员操作，因此难于满足现场快速检测要求。免疫分析方法需要免疫动物制备抗体，成本较高，而且生物抗体脆弱，容易受环境条件影响；毛细管电泳法进样量少，电渗会因样品组成而变化，进而影响分离和重现性。随着食品工业快速的发展及市场需求水平的提高，操作简便快速、灵敏度高、成本低的电化学传感检测方法已成为研究的热点[12-13]。【拟解决的关键问题】理想的修饰材料能提高工作裸电极（玻碳电极）对磺酰胺的响应灵敏度，对建立简便快速、稳定性好和灵敏度高的电化学传感方法至关重要。羧基化碳纳米管（COOH-CNTs）以其独特的一维圆管结构、优良的电子传递特性和化学稳定性等成为电极修饰材料研究的热点之一，表面大量羧基化的化学活性位点对电极进行修饰可以提高检测方法的灵敏度[14-15]。本文制备了羧基化碳纳米管修饰的玻碳电极，并通过DPV 研究磺酰胺在该修饰电极上的电化学行为及优化了电化学检测条件。以草鱼和牛奶为加标样品，建立的检测方法回收率高和稳定性好，取得了满意的结果，适用于草鱼和牛奶中磺酰胺残留检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

磺酰胺（中国食品药品检定研究院）；羧基化碳纳米管（COOH-CNTs，98%，中国科学院成都有机化学有限公司）；氯化钾、羧甲基纤维素钠、氢氧化钠、磷酸、醋酸、硼酸、乙腈等其他试剂均为分析纯；铁氰化钾混合液由5 mmol/L[Fe（CN）6]3-、5 mmol/L[Fe（CN）6]4-和0.1 mmol/L KCl 配制；0.04 mol/L Britton Robison（BR）缓冲溶液由0.04 mol/L 磷酸溶液、醋酸溶液以及硼酸配制，并用0.04 mol/L NaOH 溶液调节pH 值得到所需缓冲液；实验室用水为超纯水。

草鱼：购于南昌市不同养殖场；牛奶为市售蒙牛纯牛奶、伊利纯牛奶、阳光鲜牛奶。

1.2 仪器与设备

CHI620E 电化学工作站（上海辰华）；SB-5200D 超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；CT-6023便携式pH 计（成都恒通兴业科技有限责任公司）；WS70-1红外快速干燥箱（巩义市科华仪器设备有限公司）；玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE，Φ=3 mm）、饱和甘汞电极（SCE）、铂电极（武汉高仕睿联科技有限公司）；TG16G离心机（常州市金坛勒普仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 玻碳电极的预处理 首先在干净的麂皮上撒少许0.05 μm 粒度的Al2O3抛光粉，加适量超纯水混匀至形成白色浆状物，垂直均匀画“8”字打磨电极至光亮镜面，再依次用超纯水、无水乙醇、超纯水于超声清洗机中超声清洗5 min。电极取出后用超纯水冲洗，氮气吹干电极上的水膜后采用循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）在浓度为5 mmol/L 的铁氰化钾溶液中进行扫描（扫描速率50 mV/s，扫描电压范围为-0.2～0.6 V），得到对称、可逆的氧化还原峰，当峰电位差（ΔEp）小于100 mV即为合格，可以保证每次实验电极的表面状态和性能基本一致。

1.3.2 不同材料修饰电极的制备 分别精确称取1.00 mg 羧基化碳纳米管（carboxylic carbon nanotubes，COOH-CNTs）、氨基化碳纳米管（aminated carbon nanotubes，NH2-CNTs）、掺铂石墨烯（platinum-doped graphene，Pt-Gr）、多壁碳纳米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）、掺氮石墨烯（nitrogen-doped graphene，N-Gr）、二硫化钨（tungsten disulfide，WS2）、羧基化石墨烯（carboxyl graphene，COOH-Gr，分别分散到1 mL 0.3 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中，超声30 min，制成7种浓度为1 mg/mL的分散液。在玻碳电极表面滴涂一定量修饰材料的分散液，用DPV法检测磺酰胺。

1.3.3 DPV 法测定磺酰胺 将电极放入5.0 mL pH=7.0的BR 缓冲溶液中扫描多次至溶液稳定，取20 μL 1 mg/mL 的磺酰胺标准液于缓冲溶液中，搅拌溶液1 min 并静置1 min 后在电位范围为0.3～1.3 V 用DPV进行检测。所有实验均在室温，所有峰值电流的分析数据都是通过切线法扣除背景电流得到的DPV峰高。

1.3.4 样品的制备 草鱼样品：取2 g剪小并捣碎的草鱼样品于离心管中，加5 mL乙腈提取液，涡旋震荡2 min，超声处理10 min，4 000 r/min 条件下离心10 min 后取上清液，剩余残渣加5 mL 乙腈提取液重复提取1次，合并2次上清液，用乙腈定容至5 mL待用；牛奶样品：取50 μL牛奶样品置于离心管中，加入乙腈溶液，混匀后涡旋振荡2 min，超声处理10 min，然后在12 000 r/min 条件下离心30 min，取上清液乙腈定容至5 mL待用。

2 结果与分析

2.1 修饰电极材料的筛选

玻碳裸电极电催化性能比较弱，为了提高电极对目标检测物的灵敏度，比较了7 种不同修饰材料对磺酰胺的电化学响应，以制备的修饰电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，甘汞电极作为参比电极构成三电极体系。DPV实验结果见图1，磺酰胺在氨基化碳纳米管（NH2-CNTs）、多壁碳纳米管（MWCNTs）、二硫化钨（WS2）3 种修饰材料的峰电流比较弱，所以这3 种DPV 图没有放在图1。图1 只选择了COOH-CNTs、掺铂石墨烯（Pt-Gr）、掺氮石墨烯（N-Gr）、羧基化石墨烯（COOH-Gr）4 种修饰电极和裸玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）在含2.3×10-5mol/L 磺酰胺的BR 缓冲液（pH=8.5）的DPV 扫描图。如图1所示，磺酰胺在COOH-CNTs 修饰的电极峰电流响应最大（11.89 μA），且催化电位相对于其他的材料也略低（0.76 V），说明COOH-CNTs对磺酰胺的氧化具有最好的电催化作用。其次是N-Gr，最差的是COOH-Gr。因此，后面的实验都采用COOH-CNTs 修饰GCE制备工作电极（COOH-CNTs/GCE）。

图1 4种不同修饰材料制备工作电极的DPV扫描图Fig.1 The comparison of DPV between bare electrode and four modified electrodes

2.2 检测条件的优化

2.2.1 电极修饰材料用量的确定 采用滴涂和红外干燥法修饰电极时，如果修饰材料用量过少，则无法将裸玻碳电极表面覆盖完全，不能完全发挥出修饰材料的优势；当修饰材料用量过多时，修饰材料在电极表面形成的薄膜厚度过大，导致电子移动距离增大，不仅不能提升电极的灵敏度，甚至可能会削弱电极对目标物质的响应，从而直接影响实验结果。所以需要对电极修饰材料用量进行优化，选择合适的滴涂量以提高电极的氧化响应灵敏度。

滴涂不同体积的COOH-CNTs后在相同浓度的磺酰胺溶液中用DPV法进行扫描。如图2所示，当修饰用量在4～5 μL 的范围内峰值电流呈急剧上升趋势，5 μL 达到最大值，当用量在5～9 μL 时随着滴涂用量的增加，磺胺的峰值电流反而直线下降，且9 μL峰电流值最小。这是由于COOH-CNTs 在电极表面分布达到饱和，再增加滴涂量也不会再增加电极的比表面积和催化性能，故电极修饰用量选取5 μL作为后面实验的最适修饰用量。

图2 修饰材料用量与峰值电流关系的对比Fig.2 The comparison of the relation between the amount of modification material and the peak current

2.2.2 缓冲液pH 值的选择 电化学传感方法检测待测物的原理是被分析物在工作电极上的电化学行为与浓度变化关系，如电流响应大小随物质浓度变化的关系。而电解质溶液的pH值会影响工作电极环境中电子和质子的含量，从而直接影响电极氧化响应的灵敏度。COOH-CNTs 修饰电极在不同pH 值（pH=6.0、pH=6.5、pH=7.0、pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5、pH=9.0）的BR 缓冲溶液中对相同浓度的磺酰胺溶液的氧化响应电化学表征。

如图3 所示，缓冲液pH 值在6.0～8.5，磺酰胺的氧化响应峰的峰值电流在逐渐增大。当缓冲液的pH值达到8.5 时，氧化响应峰值电流达到最大值。之后随着pH 值的增大，峰值电流又开始逐渐减小，这表示缓冲液在pH 为8.5 时，修饰电极对磺酰胺的氧化还原响应最强，故选取pH=8.5 的BR 缓冲液作为实验的最佳电解质溶液。

图3 不同pH的缓冲液对磺酰胺电化学响应的影响Fig.3 The effect of buffers with different pH values on the electrochemical response of sulfanilamide

2.3 COOH-CNT/GCE的电化学表征

2.3.1 COOH-CNT/GCE 的电化学阻抗性能 交流阻抗性能可以反应电极导电性的强弱，为了研究修饰电极COOH-CNT/GCE 的导电性，进行了交流阻抗实验，在5 mmol/L 的铁氰化钾混合液中研究了电极的界面性质，通过奈奎斯特图中半圆的直径来评价不同改性的电极的转移电阻（Rct）。从图4 可以看出，COOH-CNT/GCE 的电极明显比未修饰电极的Rct小，反映了采用COOH-CNT 材料修饰玻碳电极后大大提高了工作电极的导电能力。

图4 在5 mmol/L铁氰化钾混合液中GCE和COOH-CNT/GCE 的奈奎斯特图Fig.4 The nyquist plots of GCE and COOH-CNT/GCE in 5 mmol/L potassium ferricyanide mixture

2.3.2 COOH-CNT/GCE 电极催化有效面积 电极催化有效表面积的大小决定了电化学传感器的响应位点数量，通常有效面积越大，电极电催化性能越好，响应灵敏度越高。在含0.1 mol/L KCl 的1 mmol/L K3[Fe（CN）6]为支撑电解质溶液中，对所制备的电化学传感器进行了电化学有效表面积的研究。图5显示COOH-CNT/GCE大大提高了未修饰电极的电化学有效面积，增强了对磺酰胺的识别与响应。

图5 在含0.1 mmol/L的1 mmol/L的铁氰化钾溶液中对GCE和COOH-CNT/GCE 的电化学有效表面积测试Fig.5 The electrochemically available surface area measurements of GCE and COOH-CNT/GCE in 1 mmol/L potassium ferricycyanide solution containing 0.1 mmol/L

2.3.3 绘制标准曲线及检测限的计算 在最优实验条件下，用修饰电极在0.3～1.3 V 电位下采用DPV 法对含不同浓度磺酰胺（9.29×10-6，1.63×10-5，1.97×10-5，2.32×10-5，3.25×10-5，8.31×10-5，1.16×10-4，2.32×10-4，2.90×10-4mol/L）的缓冲液进行检测分析，得到不同浓度下的氧化响应峰值电流图。根据浓度与氧化峰值电流的关系，以浓度为横轴、峰值电流为纵轴绘制标准曲线，结果如图6所示。

由图6可知，磺酰胺浓度在9.29×10-6～2.9×10-4mol/L的范围内，氧化响应峰值电流与磺酰胺浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为：y=0.008 7x+0.095 5，R2=0.991 6，检测限为6.21×10-6mol/L。

图6 磺酰胺浓度与峰电流响应的线性关系Fig.6 Linear relationship between sulfonamide concentration and peak current

2.3.4 重复性和重现性 使用同一根COOH-CNTs 修饰电极在最优实验条件下对含2.3×10-5mol/L 磺酰胺浓度的缓冲溶液进行重复性实验，采用DPV 法重复扫描12 次（如图7A），测得12 次实验结果的氧化峰值电流的相对标准偏差RSD=1.99%，表明该传感器对磺酰胺检测的重复性非常好。

使用6 根COOH-CNTs 修饰的不同电极，在最优实验条件下对含2.3×10-5mol/L 磺酰胺浓度的缓冲溶液进行重现性实验，使用DPV 法重复扫描5 次得到平均峰电流值（如图7B），测得平均氧化峰值电流值的相对标准偏差RSD=3.74%，表明该传感器对磺酰胺检测的重现性良好。

图7 DPV法扫描同一根修饰电极峰值电流变化（A）；6根COOH-CNT/GCE 修饰电极的峰值电流变化（B）Fig.7 Peak current variation diagram of the same modified electrode by DPV method（A）；Peak current changes of six COOH-CNTs/GCE modified electrodes（B）.

2.3.5 加标实验及实际样品的测定 加标回收率的测定不仅可以评估基质效应对方法的影响，而且可以评估该方法的准确度[16-17]。采用江西最大的淡水鱼品种草鱼和蒙牛牛奶作为加标样品进行方法验证，选择了4个不同的加标浓度，测定了加标回收率和RSD值，结果见表1。

由表1 可知，添加4 个不同浓度的草鱼加标回收率在97.91%～105.32%，RSD 在0.81%～2.79%。牛奶样品的加标回收率达到91.48%～101.75%，RSD 在0.63%～3.72%。可见本研究以草鱼和鲜奶样品为基质建立的电化学传感方法表现了非常好的回收率和精密度，表明该建立的方法可以适用于上述两类样品检测，进一步采用该传感方法检测了10 种不同养殖地的草鱼样品和3 种品牌的牛奶样品都未检出磺酰胺残留。

表1 草鱼和牛奶样品的加标回收率（n=5）Tab.1 The recovery rate of grass carp and milk sample with spiked standard（n=5）

3 结论与讨论

本次研究成功开发了一种简便、快速、灵敏度高和成本低的检测磺酰胺的电化学传感方法，当采用COOH-CNTs 修饰的玻碳电极表现出优良的电子催化性能、高比表面积，该电极对磺酰胺电化学响应灵敏度高。制备的电极在重复使用12次稳定性非常好，采用相同的滴涂条件制备了6根电极，重现性也非常满意。建立的电化学传感方法检测磺酰胺，操作简便快速、灵敏度高，采用该方法对草鱼和牛奶样品中磺酰胺的4个加标浓度样品进行检测，回收率为91.48%～105.32%，表明建立的方法可以适用于实际样品检测。从2020年磺胺类药物残留报道来看，水产品、畜禽产品、鲜奶和蜂蜜产品，甚至饮用水等都有阳性样品报道，因此磺胺类在食品中的残留应该引起监管部门的重视。目前已开发的磺胺类药物有30多种，食品中常见残留的有10多种磺酰胺的衍生物，因此后期实验研究能同时检测多种磺胺的电化学传感方法具有更重要的意义。