HPLC法测定舞阳贝母水溶性成份含量及指纹图谱分析

李 珊，王晓燕，黄 霞，张红伟*，刘 菊，赵一擎，茹庆国

(1 河南省食品药品检验所，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 450018；2 郑州市中医院，郑州 450007)

贝母为百合科贝母属多种植物的干燥鳞茎，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肃、湖北、安徽等省[1]。2020年版《中国药典》一部药材与饮片项下收载了6种不同来源的药用贝母，分别为浙贝母(百合科植物浙贝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鳞茎)、土贝母[葫芦科植物土贝母Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet的干燥块茎]、湖北贝母(百合科植物湖北贝母FritillariahupehensisHsiao et K.C.Hsia的干燥鳞茎)、川贝母[百合科植物川贝母FritillariacirrhosaD.Don、暗紫贝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母FritillariaprzezvalskiiMaxim.、梭砂贝母FritillariadelavayiFranch.、太白贝母FritillariataipaiensisP.Y.Li或瓦布贝母FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsiavar.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu, S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎]、平贝母(百合科植物平贝母FritillariaussuriensisMaxim.的干燥鳞茎)、伊贝母(百合科植物新疆贝母FritillariawalujewiiRegel或伊犁贝母FritillariapallidifloraSchrenk的干燥鳞茎)。贝母的植物来源种类繁多，遍布全国各地，但药典中收载的川贝母野生资源逐渐枯竭，因此各地均有替代品[2]。

现代药理研究表明，贝母具有抑菌[3-5]、镇咳[6-7]、平喘[8-9]、抗肿瘤[10-12]等作用。核苷类属于贝母中的水溶性成份，有研究表明，贝母的水溶性成份具有松弛平滑肌、抑制血小板聚集、降压、抗炎等作用[13]，而贝母的抗炎作用能协同治疗呼吸道感染，是贝母止咳化痰的药理学基础[14]。

舞阳贝母为百合科植物舞阳贝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶，于1983年在河南省野生经济植物资源考察中发现，以舞钢市为中心，多分布在海拔230～700 m的疏林草地或山坡草丛，疗效确切，是河南省特有的中药材贝母资源[15]。舞阳贝母质量标准于2019年通过专家评审，现收入《河南省中药饮片炮制规范标准草案》，且已进入“河南省中药饮片炮制规范研究”课题品种名单。但由于相关研究基础薄弱，特别是对其化学成份的研究较少，现有质量标准较为简单，只有性状、鉴别、检查、浸出物项目，没有含量测定项目，未制定质量等级，也未与其他川贝母、浙贝母等药材进行更加深入的质量比较。因此，作为豫产特色中药材，对舞阳贝母进行质量评价研究，在提高药材质量控制水平、确保药材质量、保证临床用药的稳定性和有效性方面具有重要意义。

舞阳贝母入药多为水煎口服，已有多项研究针对贝母中核苷类成份的含量进行了测定[16-24]。核苷类物质是生物机体细胞维持生命活动的基本组成元素，具有多种生物活性[25]，可作为舞阳贝母的质量评价指标之一。本研究对舞阳贝母中的9种核苷类成份进行含量测定，并首次建立其水溶性成份HPLC指纹图谱，以期为舞阳贝母的进一步开发利用和质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 Infinity液相色谱系统、AgilentDEAA311731二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)；XPE205万分之一电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；粉碎机(漯河金田试验设备研究所)；SIGMA3-30KS高速台式冷冻离心机(德国西格玛公司)；Mili-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 试药

尿嘧啶对照品(批号：100469-201302，含量以99.6%计算)、次黄嘌呤对照品(批号：140661-200402，含量以99.0%计算)、腺苷对照品(批号：110879-200202，含量以100.0%计算)、尿苷对照品(批号：887-200202，含量以100.0%计算)、腺嘌呤对照品(批号:110886-200001，含量以100.0%计算)、鸟苷对照品(批号：111977-201501，含量以93.6%计算)均购自中国食品药品检定研究院；胸苷对照品(批号:ML190825-06，含量以98.0%计算)、胞苷对照品(批号:TI180107-17，含量以98.0%计算)、2′-脱氧腺苷对照品(批号:AL181124-13，含量以98.0%计算)均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇(德国默克股份两合公司，色谱纯)；超纯水为自制。

实验用9批舞阳贝母样品来自不同产地，采用3种不同加工方式加工而成，经河南省食品药品检验所鉴定为百合科植物舞阳贝母FritillariawuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶。样品信息见表1。

表1 9批舞阳贝母样品来源信息

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取舞阳贝母样品适量，粉碎机粉碎，过3号筛。取约1.5 g，精密称定，置50 ml具塞锥形瓶中，加纯水10 ml，摇匀，称定重量，室温下超声提取60 min(功率300 W，频率50 kHz)，取出放冷至室温，加纯水补足减失的重量，摇匀，转移至10 ml离心管，离心5 min(10 000 r/min)，经0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

分别取尿嘧啶对照品、胞苷对照品、次黄嘌呤对照品、尿苷对照品、腺嘌呤对照品、鸟苷对照品、胸苷对照品、腺苷对照品、2′-脱氧腺苷对照品适量，精密称定，加水制成质量浓度分别为118.325、101.528、103.356、101.520、102.400、91.653、109.760、111.520、119.717 μg/ml的混合对照品储备液，置4 ℃冰箱内保存，备用。

2.3 色谱条件

采用YMC-Triart C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱(见表2)；柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min；检测波长为260 nm；进样量为10 μl。

表2 梯度洗脱程序

2.4 方法学考察

2.4.1系统适用性试验

按照“2.3”项下色谱条件，取对照品溶液和供试品溶液分别进样，色谱图见图1。

1：尿嘧啶；2：胞苷；3：次黄嘌呤；4：尿苷；5：腺嘌呤；6：鸟苷；7：胸苷；8：腺苷；9：2′-脱氧腺苷

各相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10 000，表明上述色谱条件可有效分离各目标成份，可用于舞阳贝母的含量测定研究。

2.4.2线性关系考察

精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液0.1、1、2、4、8、10、20 ml，分别置于7个20 ml容量瓶中，加水稀释并定容，摇匀，制成系列浓度梯度的混合对照品溶液，精密吸取10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，由结果可知9种核苷类成份在各自浓度范围内线性关系良好，见表3。

表3 9种核苷类成份的线性关系

2.4.3精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μl，连续进样6次。测得胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷峰面积的RSD分别为1.05%、1.23%、0.85%、0.34%、0.67%、0.34%、0.29%、0.48%和0.98%，表明仪器精密度良好。

2.4.4重复性试验

取S4号样品粉末1.5 g，共6份，精密称定，平行制备6份供试品溶液(按“2.1”项下方法)，测定9个核苷类成份含量(按“2.3”项下色谱条件)，结果胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷RSD分别为1.86%、1.57%、2.11%、0.98%、1.84%、1.95%、1.49%、1.36%、1.77%，表明本方法重复性良好。

2.4.5稳定性试验

取S4号样品制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、36 h进样测定，测得胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鸟苷、腺苷、2′-脱氧腺苷峰面积的RSD分别为0.68%、0.91%、0.87%、0.77%、0.94%、0.75%、0.67%、0.96%、0.72%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.4.6加样回收率试验

取已知含量的S4号样品共6份，每份约0.75 g，精密称定，分别精密加入尿嘧啶对照品溶液(49.10 μg/ml)、胞苷对照品溶液(10.82 μg/ml)、次黄嘌呤对照品溶液(9.18 μg/ml)、尿苷对照品溶液(541.82 μg/ml)、腺嘌呤对照品溶液(29.18 μg/ml)、鸟苷对照品溶液(420.36 μg/ml)、胸苷对照品溶液(200.12 μg/ml)、腺苷对照品溶液(301.17 μg/ml)、2′-脱氧腺苷对照品溶液(130.18 μg/ml)各1 ml，加水至10 ml，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”色谱条件下测定，并计算回收率及RSD，结果表明回收率良好，见表4。

表4 9种核苷类成份加样回收率结果

2.4.7含量测定

取各批次舞阳贝母样品适量，精密称定，按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定。结果表明，不同批次舞阳贝母样品中核苷类成份总量差异较大，且各成份含量也相差较大。

表5 9批舞阳贝母样品的核苷类成份含量测定结果 n=3，μg/g

2.5 指纹图谱的建立及相似度分析

将各批次舞阳贝母样品色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2012版)”，建立9批河南不同产地舞阳贝母指纹图谱的共有模式。以S1号样品色谱图为参照图谱，设定匹配模板，进行谱峰多点校正，时间窗宽度为1.0 min，生成对照图谱(见图2)，共确定15个共有色谱峰。通过与对照品比对，指认了9个成份，即峰1为尿嘧啶、峰2为胞苷、峰4为次黄嘌呤、峰5为尿苷、峰8为腺嘌呤、峰9为鸟苷、峰11为胸苷、峰13为腺苷、峰14为2′-脱氧腺苷。对各批次舞阳贝母样品指纹图谱与对照图谱进行相似度计算，S1～S9的相似度分别为0.910、0.891、0.843、0.822、0.906、0.889、0.906、0.857、0.865，范围为0.822～0.910。相似度评价结果表明，河南产舞阳贝母指纹图谱基本一致，见图3。

1：尿嘧啶；2：胞苷；4：次黄嘌呤；5：尿苷；8：腺嘌呤；9：鸟苷；11：胸苷；13：腺苷；14：2′-脱氧腺苷

图3 9批舞阳贝母样品HPLC叠加图谱(S1～S9)

3 讨论

3.1 提取条件优化

在制备供试品溶液时考察了不同提取方法(超声、回流)和不同溶剂(纯水，10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液)，发现纯水超声提取效率最高，操作简便，且提取过程中无需加热、无化学反应发生，对测定组份的量没有损失。进一步考察了溶剂用量(10、20、30 ml)及提取时间(30、60、90 min)，最终确定提取方法为10 ml纯水超声提取60 min。

3.2 色谱条件优化

本实验考察了甲醇-水、乙腈-水为流动相，在不同的梯度洗脱条件下进样，采用5种不同色谱柱Waters-Symmetrm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC-Triart C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、JADE-PAKRS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agela-Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，同时比较了不同进样量(5、10、15 μl)，不同流速(0.5、0.8、1.0 ml/min)、不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，根据色谱图基线、出峰数目、理论塔板数及分离度确定了本实验的色谱条件。

3.3 检测波长的选择

采用DAD检测器，在200～400 nm波长范围内对对照品及样品进行扫描，综合考虑不同波长下色谱峰的数目、紫外吸收、分离度、峰面积大小，最终确定260 nm为最佳检测波长。

3.4 测定结果分析

本实验首次建立了舞阳贝母药材中水溶性成份(胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、2′-脱氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鸟苷、腺苷)的含量测定方法。该方法可使舞阳贝母水提取物中9种核苷类成份有效分离，且精密度、重复性、稳定性较好。9批舞阳贝母样品中的9种核苷类成份(胞苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、2′-脱氧腺苷、尿苷、腺嘌呤、胸苷、鸟苷、腺苷)含量平均值分别为45.54、24.87、10.39、103.58、407.45、32.45、189.17、441.08、368.17 μg/g，其中次黄嘌呤含量普遍较低(≤21.77 μg/g)，鸟苷含量普遍较高(≥318.39 μg/g)，可见不同批次的舞阳贝母样品中9种核苷类成份含量差异较大；其次，9批舞阳贝母样品(S1～S9)中9种核苷类成份的总量分别为1014.08、1526.59、1513.57、1563.99、1578.57、2256.64、1876.04、1884.99、1389.76 μg/g，可见各批次间核苷类成份总量也相差较大。

本实验收集的9批舞阳贝母样品是由硫熏、传统炕制和烘箱烘干3种不同的产地加工方法加工而成，由测定结果中的9种核苷类成份总量可知，烘箱烘干的样品含量最高[(2005.89±217.20)μg/g]，其次是传统炕制[(1514.50±74.60)μg/g]，硫熏含量最低(1014.08 μg/g)，表明不同产地加工方法对9种核苷类成份总量会产生较大影响，烘箱烘干损失较小，而硫熏损失较大。有研究表明硫黄熏蒸不仅使中药材及饮片残留大量二氧化硫，还伴随有复杂的化学反应，会导致多种有效成份的化学结构和含量发生改变[26-27]。硫黄熏蒸对中药核苷类成份的影响及其作用机制还有待进一步研究证实。

3.5 指纹图谱分析

中药指纹图谱能全面地反映中药所包含的复杂化学成份信息，是国内外公认的中药质量控制有效手段。中药指纹图谱数据库作为中药鉴定发展的有效平台，其研究和建立是中药质量控制规范化、全面化、标准化的重要途径[28]。HPLC法以其应用范围广、分离效能高、使用自动化、灵敏度高等优点成为建立中药指纹图谱的常用方法[29]。本研究构建了舞阳贝母水溶性成份HPLC指纹图谱，同时对其含量进行评定，建立9批舞阳贝母水溶性成份指纹图谱的共有模式，确定了15个共有色谱峰，并通过对照品保留时间定位对其中9个峰进行了指认。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2012版)”进行相似度评价，9批舞阳贝母相似度在0.822～0.910，表明河南不同产地舞阳贝母水溶性成份指纹图谱基本一致，为舞阳贝母的综合质量评价提供了一定依据。

4 小结

本试验建立了河南特色药材舞阳贝母中核苷类成份的含量测定方法并初步建立了HPLC指纹图谱，对不同批次舞阳贝母进行了质量综合评价，为从整体上控制舞阳贝母药材的质量提供了更加简便直观的方法。