海参高抗“毒”（有机磷农药）机理初探

陆惠莲，曹慕华，梁晓霞，谭文婷，彭靖服，原丽红

（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006）

2020 年央视“3·15 晚会”以“海参水‘深’，养海参竟然整箱放敌敌畏”为题，曝光了山东即墨部分养殖户在海参养殖过程中违规使用敌敌畏清池的养殖乱象，引发社会广泛关注[1]。有机磷农药进入水体后，可在生物体内积蓄，对养殖环境及水产生物产生不容忽视的影响，最终将危害人类安全，因此在含有有机磷农药敌敌畏的水体中，同池塘中鱼、虾、蟹等生物相继死亡，而海参却能正常存活，其抗“毒”（有机磷农药）机理成为人们谈论的热点话题。文献[2-4]显示，海参对多种有机磷农药的抗性较强，当前尚无海参对敌敌畏抗药性的直接数据，海参抗有机磷农药机理至今不明。为探究海参抗有机磷农药的潜在机理，现以玉足海参为研究对象，通过敌敌畏等有机磷农药的毒性反应和海参自身结构及行为特点，分别对海参免疫、呼吸、消化、神经四大系统降解、代谢敌敌畏的机理进行研究，以期为海参养殖、加工和食用安全提供理论基础。

1 有机磷农药的应用和毒性机理

1.1 有机磷农药的使用情况

自20 世纪80 年代有机氯农药被禁用后，新一代有机磷农药因具有易降解、不易被生物富集、对杀灭靶生物毒性大、对生态环境影响较小等优点[5]，成为目前我国农药市场所占份额最大、农业生产使用最广泛的一类农药，广泛应用于种植业。我国作为农业大国，合理地使用农药可以保障粮食的产量，如果停止使用农药，我国粮食的产量会减产25%~30%，将有约3.5 亿人挨饿[6]，但农药的超范围和超量使用会给生态系统和人体健康带来巨大的危害。农药施用于农田后，仅有10%~20%会进入空气并被植物吸收，剩余的80%~90%将进入土壤，并按不同途径扩散到其他环境介质中[7]。农药进入土壤后，可随河流、大气、工业排放等方式汇入海洋，更有研究指出，沿海地区比内陆地区农药使用量大[8]，因此农药最终会在水体中富集，对水生生物产生影响。研究发现，国内水环境中，农药残留以有机氯类（Organochlorine pesticides, OCPs）和有机磷类（Organophosphorus pesticides, OPs，包含乐果、氧化乐果、敌敌畏、对硫磷、甲基对硫磷、三唑磷、敌百虫等）为主，OPs残留浓度最高，且含量高于 OCPs[9]；Gao 等[10]在农药残留调查中发现，中国七大河流和三大流域地表水的OPs 残留现象严重；田澍等[11]在南通市地表水质监测点，发现农田附近的不同区域的水样可检出有机磷农药致螟磷和对硫磷，其含量最高达15.6 μg/L；朱丽芳等[12]定量检测了杭嘉湖乐果含量，检出最大浓度达到30 180 ng/L；许红睿等[13]定量研究了江苏部分地区13 个水厂的水源水和出厂水中的49 种半挥发性有机污染物，检出部分常用有机磷农药，其中敌敌畏的检出率达到了100%。不仅仅在流域水体方面，有机磷农药的残留也涉及了水生生物。在海南省最大的松涛水库中，发现鱼类体内残留甲基对硫磷农药[14]；在山东省的微山湖水系的太白湖中，发现河蚌体内存在敌敌畏残留[15]，其风险已超过人体所能承受的范围。由此可见，有机磷农药污染具普遍性，而未来在农业上仍会被广泛使用。国内水域污染情况及2020 年央视“3·15 晚会”曝光的敌敌畏清池事件，反映出养殖户对农药使用安全意识不强、水域中有机磷药物残留现象较严重等问题，这终将影响生态环境的稳定、水生生物乃至人类的安全。

1.2 有机磷农药对水生生物毒性作用机制

敌敌畏、乐果、对硫磷等有机磷农药是一种神经毒剂，主要通过干扰生物神经系统功能进而对生物体产生毒害作用。目前已发现的有机磷类农药对水生生物的毒性机制主要有3 种。一是OPs会抑制胆碱酯酶活性，使生物体内乙酰胆碱大量堆积，毒蕈碱受体和烟碱受体能持续兴奋，长期刺激受体，阻断神经细胞去极化，引起神经传导失常，神经代谢生理功能紊乱，导致生物体中毒死亡[16]。二是OPs 会诱导细胞产生氧化应激反应，通过产生大量自由基，使机体超氧化物歧化酶（SOD）活力降低，过量的自由基数量超过生物体抗氧化体系的还原能力。导致细胞遭受氧化损伤，进而损伤线粒体等细胞器，线粒体损伤可以导致多种系统受影响，引起不同的细胞、组织和器官疾病[17]。三是乐果、敌敌畏、甲胺磷等有机磷农药引起生物体中毒后，生物体会产生“中间综合征”，以肌肉无力、呼吸困难等为特征[18]。

1.3 有机磷农药对水生生物毒性的相关研究

通过对中国知网数据库（CNKI）学术期刊进行检索［关键词：有机磷农药（Organophosphorus pesticides）］，筛选并总结了自 2002 年 1 月 1 日至2020年12 月31 日有机磷农药对水生生物毒性方面的文献（图1），相关研究选取的物种情况，见图2。可以看出，有机磷农药对水生生物毒性方面的研究逐年增加，且主要集中在斑马鱼、海胆等模式生物及鱼、虾、贝类和海参等经济动物中。

图1 有机磷农药对水生生物的毒性方面文献发表数量

图2 全球有机磷农药毒性研究选取的水生生物种类

刘亚莉等[19]构建了淡水水生生物对敌敌畏的物种敏感性分布模型，发现不同水生生物对敌敌畏的敏感度不同。现整理了敌敌畏对常见水生生物（鱼、虾、贝类）的急性毒性数据，见表1。由表1 可见，敌敌畏对虾类、贝类的半致死浓度（LC50）较低（0.008~3.796 mg/L），对鱼类的 LC50较高（23.300~66.189 mg/L）。由于未检索到海参对敌敌畏抗性的直接数据，查找了近年来有关敌百虫、三唑磷等有机磷农药对海参的影响的研究数据，确定了敌敌畏对玉足海参幼苗（260 日龄）的LC50为103.062~277.943 mg/L，见表2。由表 2 可见，海参对有机磷农药的抗性普遍较强。

表1 敌敌畏对常见水生生物的毒性影响 mg/L

表2 不同有机磷农药对海参的毒性影响 mg/L

2 海参生理特点与其潜在的抗“毒”机理

海参（Sea cucumber），属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲（Holothuroidea），自古以来就被认为是一种名贵的滋补食材，位列“八珍”之一。海参含有多种生物活性物质，如海参多糖、海参皂苷、海参胶原蛋白、海参多肽及脂类物质等[26]，这些活性成分具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血及延缓衰老、降血脂、降血糖、防止动脉硬化、增强免疫力和提高记忆力等多种保健作用。伴随经济不断发展，消费者对身体健康日益重视，对名贵滋补食品海参的需求剧增。仅2008 年，全球干海参产量超过2 万 t，海参产业遍布 70 多个国家[27]；2018 年，全球干海参总产量达3.93 万t，其中我国干海参的产量约为4 379 t；至2020 年，中国刺参鲜参产量已达20 万t，直接经济效益300 多亿元，全产业链产值达1 000 亿元[1]。海参需求量及产量与日俱增，海参养殖过程中敌敌畏的乱用和海参高抗“毒”现象引发了广泛关注。现梳理了近20 年关于海参的生理结构特点相关研究成果，从海参的免疫系统、神经系统和消化系统等方面特点探讨海参抗有机磷农药的潜在机理。

2.1 海参免疫系统

2.1.1 基本特征 海参属于无脊椎动物，缺乏脊椎动物所具有的特异性免疫系统，只具有非特异性免疫系统，其免疫功能主要通过体壁防御和体内免疫来完成。体壁防御是海参抵抗外来病原体的第一道防线[28]。海参的体内免疫应答分为细胞免疫和体液免疫两个部分。细胞免疫主要通过大量的体腔细胞来完成，体腔细胞有吞噬细胞及3 种球状细胞。吞噬细胞显示出2 个不同的形态：花瓣形和丝状形，前者参与外源物质的吞噬，后者则在凝血和组织修复中发挥作用。3 种球状细胞包括Type I细胞、Type II 细胞和Type Ⅲ细胞[29]。体液免疫反应以体腔细胞分泌的各种免疫因子进入体腔为基础[30]，免疫因子主要存在于海参体腔液中，包括凝集素（apostichopus japonicus lectin, AJL）、溶血素（hemolysin）、补体系统（complements system）以及溶菌酶（lysozyme, LSZ）、酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化物酶（peroxidase, POD）等，它们能够对外来的入侵者进行识别和攻击。其中ACP、AKP、LSZ、SOD和POD 这5 种酶是机体免疫调控的重要成分[31]。该研究发现，随着敌敌畏浓度升高海参体内SOD活性呈下降趋势（未发表数据），这体现了海参免疫因子对有机磷环境的应答。

2.1.2 潜在机理 线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要细胞器。线粒体呼吸链中如果有电子漏出，则会产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），导致氧化损伤。活性氧通过夺取细胞体内富电子物质的电子而对细胞产生毒害作用，进一步诱导细胞线粒体结构及功能的改变，引起细胞凋亡和坏死[32-33]。

文献[34]指出，有机磷农药会诱导细胞产生氧化应激。氧化应激会加快线粒体产生活性氧的速度，使机体内ROS 生成过多，导致神经元、髓鞘被严重破坏，如果不及时清除，便会引起蛋白质失活、DNA 链断裂和膜脂过氧化，使细胞遭受氧化损伤，导致生物体死亡。

海参具有发育良好的抗氧化防御系统，包括抗氧化酶如SOD、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）等，可以直接清除有害的ROS 和其他与ROS 生成有关的化合物[35]，保护机体免受此种氧化损伤。SOD 是海参体腔免疫中的关键酶，能催化O2-发生歧化反应，加速O2-转变为H2O2和O2，从而消除O2-，在维持机体活性氧代谢的平衡中起重要作用[36]。海参的体壁和各种免疫细胞与免疫因子组成强大的免疫系统，在消除有机磷农药引起的氧化应激反应所产生的活性氧方面起重要作用。此外，活性氧ROS 还受到miRNAs 的调节，影响海参的免疫反应[37]。

2.2 海参呼吸系统

2.2.1 基本结构 呼吸树（respiratory tree）是海参类特有的呼吸器，为半透明的分枝状憩室，但只见于枝手目、循手目和芋参目。呼吸树的根部位于泄殖腔上端和大肠交界处，在肠道左侧和右侧的体腔内各有一分支，并通过细小的结缔组织脊与体壁相连，其末端呈小囊状，形圆、壁薄。呼吸树由外向内依次为体腔上皮、肌层、血腔、内皮细胞和中央腔[38]，其组织学和消化道相似，实际上它是消化道的突出部分，周围散布有体腔细胞，特别是有色球形体居多，内有许多待排泄颗粒。

2.2.2 潜在机理 海参通过膨大呼吸树，增生上皮细胞等方式抵御有机磷农药的毒性。Telahigue等[39]使用草甘膦（Glyphosate, GLY）及其商业剂型RD○R短期作用于海参的呼吸树（96 h），通过组织病理学观察，发现暴露于草甘膦的海参呼吸树出现了增生，且出现内膜上皮肥大及融合，肌肉层受损且变薄，体腔上皮被侵蚀并肥大，内膜上皮有部分脱落、解体的现象。笔者研究发现，玉足海参经一定浓度的敌敌畏处理后出现体腔上皮细胞被侵蚀且局部肥大、融合，肌层变薄并出现损伤断裂，结缔组织明显增生，中央腔狭窄等现象（未发表数据），可见海参的呼吸树为有机磷农药主要损伤的部位之一。此外，呼吸树不仅参与海参的呼吸运动，还参与其排泄过程。呼吸树内皮细胞的质膜囊泡多集中于细胞上部，可摄入海水中的大分子物质。被摄入的物质经细胞消化后，会转化为小分子物质。这种摄取和消化一方面使内皮细胞吸收海水中的营养物质，另一方面又可降解海水中的有毒物质[40]。因此呼吸树的增生可能是海参加速物质交换、排出有机磷农药残留的结果，这或许是其抵抗有机磷农药毒害的一种方式。

2.3 海参消化系统

2.3.1 基本结构 海参消化系统主要包括口、咽、胃囊、肠道和泄殖腔5 个部分，肠道是海参消化系统重要组成部分，环绕分布于体腔之中，管长一般为体长的3 倍左右，是海参体内最大的内脏器官[38]。根据其位置及形状差异，海参肠道可分为前降肠、前升肠和后降肠，靠肠系膜连接于体壁。前降肠颜色最深，至前升肠颜色逐渐变浅且变细，内壁形成环形褶皱；后降肠肠壁明显变薄，其颜色最浅，兼有许多卷曲，内壁形成高而窄的褶皱，常充满食物残渣，主司消化和吸收[41]；肠道末端膨大成为泄殖腔，分支衍生出呼吸树。

2.3.2 潜在机理 以有机磷农药敌敌畏为例，海参肠道内已发现能降解敌敌畏的菌群，这可能是海参对敌敌畏等有机磷农药具有高度抗性的原因之一。海参肠道微生物群落非常丰富，其中的肠道菌群已被证明是维持其健康的重要因素，并且对其生长和功能具有广泛的影响。当海参进食藻类、底泥等物质后，其肠道菌群会将大分子有机物分解成小颗粒，进而生成可供肠道吸收的小分子，为机体提供能量。李智等[42]、李建光[43]和张文姬[44]分别研究发现，芽孢杆菌属和假单胞菌属为海参肠道优势菌群，丰度为22.0%~36.9%和17.4%~33.3%。杨瑞红等[45]及孙薇等[46]分别在土壤中分离出多株假单胞菌（如变形假单胞菌、恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌等）和芽孢杆菌（如土壤短芽孢杆菌），皆对敌敌畏具有较好的降解作用，其中包含降解有机磷效率高达84.1%的菌株。同为水生生物，鱼类和虾类肠道中主要以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门的菌群为主，分别占鱼类和虾类肠道菌群的90%和65%以上[47]。通过对比不难发现，海参肠道内含有高丰度的能降解敌敌畏的菌群可能是海参对敌敌畏具高抗性的原因之一。然而目前无研究证明海参肠道菌群与敌敌畏等有机磷农药的相关性，因此值得进一步研究。

2.4 海参神经系统

2.4.1 基本结构 棘皮动物的神经系统呈放射状，结构相对简单，由3 个神经网络（外神经网络、下神经网络和内神经网络）结合成神经索[48]。而海参的神经系统较为独特，以神经环为中枢，向外分化出连接口部周围触手的神经节及5 条辐神经。辐神经是一条扁平的神经节状索，辐神经外侧的腔称为上神经窦，上神经窦的前端形成分支窦通向各个触手；辐神经内侧的腔称为下神经窦，下神经窦形成分支通向体壁直到肌肉纤维，控制运动[38]。

除此以外，海参各个脏器的体腔上皮都受到内脏神经丛的支配，内脏神经丛以孤立的神经元为单位，由肌肉层和纤维延伸到其他组织层，并控制着与内脏活动相关的肌肉组织[49]。在肠道方面，海参肠神经系统可分为基底上皮神经丛、内脏神经丛、黏膜神经内分泌神经丛和结缔组织神经丛四部分，分别对肠道的上皮层、肌肉层、肠腔内壁表皮层和内部结缔组织层进行控制[50]。在呼吸方面，海参的内脏神经丛支配呼吸树上皮，从而控制其呼吸运动[51]。

2.4.2 潜在机理 在海参神经系统中，胆碱酯酶起着重要的作用。海参含有丰富的乙酰胆碱酯酶，用于降解累积过多的乙酰胆碱。乙酰胆碱被认为是海参运动系统中的主要神经递质，介导运动神经元和感觉神经元的传递，诱导成年海参的肠道肌肉收缩。同时，海参神经元释放的囊泡被认为是胆碱能物质，其结构类似于含乙酰胆碱的囊泡，但胆碱能神经元仍未有确切定位[52]。

有机磷农药能够通过与胆碱酯酶不可逆的结合，从而抑制胆碱酯酶的活性[17]，对海参神经系统产生影响。胆碱酯酶活性的降低会导致乙酰胆碱的堆积，导致肠肌肉长期受到乙酰胆碱的刺激，Chen 等[53]指出海参在不良环境下或受到刺激后，会触发“刺激—吐脏—自保”的行为机制，孙修勤等[54]表示其吐脏机理非常复杂，主要分为3 阶段：一是内脏连接韧带和泄殖腔、肠系膜及体壁肌腱连接韧带的快速软化；二是体壁或泄殖腔强烈的局部软化；三是肌肉收缩并断裂、弱化，继而排出失去韧带连接的内脏。研究表明，海参吐脏行为发生时其自切位置基本恒定[55]，最终会使海参肠道和呼吸树完全排出体外。周翊[18]指出，敌敌畏等有机磷农药引起生物体中毒后，生物体会产生“中间综合征”，以肌肉无力、呼吸困难等为特征。而海参的呼吸系统是呼吸树，主要的肌肉组织是肠道，这两个部分受到敌敌畏等有机磷农药的损害可能最为严重。海参在敌百虫、三唑磷、草甘膦环境下均能发生吐脏反应[22-24]。该研究发现，海参在有机磷农药45~240 mol/L的环境中出现吐脏现象，且首次出现吐脏的时间随浓度的增大而前移（未发表数据），说明海参在高浓度敌敌畏的刺激下，触发该保护机制的时间缩短，使其尽可能排出敌敌畏的毒素，但是在吐脏之后，仍处于敌敌畏环境下的海参未出现再生现象。结合现有研究数据表明，海参通过吐脏这种自我保护行为，将敌敌畏损伤明显的靶器官（呼吸树和肠道）排出体外，可使海参体内有机磷农药含量降低，进而减少其对海参的毒害作用，但在该机制下海参抵抗有机磷损害的程度有限。

3 结语

有机磷农药在我国农业中扮演着不可或缺的角色，但由此带来的环境污染与超范围使用现象所造成的食品安全问题也成为人们关注的热点之一。根据现有研究数据不难发现，海参对敌敌畏等有机磷农药具有较高的抗药性，然而现阶段研究大多集中于对有机磷农药急性毒性数据的测定和海参病理组织损害程度的观察，关于海参抗有机磷农药的机理研究较少。因此，全面挖掘海参的高抗“毒”机理将为海参的安全养殖和精深加工提供理论依据，具有较高的学术意义和产业价值。今后应重点关注海参肠道菌群（尤其是能降解有机磷农药的菌群）、吐脏现象以及免疫应答因子等方面在调节海参抗有机磷农药损伤过程中发挥的作用。