ST 贴壁细胞悬浮驯化及应用

何锡忠，林 鸷，赵本进，朱永军，彭丽英

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

细胞悬浮培养技术按照细胞的贴壁性质可分为悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体悬浮培养[1]。微载体培养系统不适合在普通摇瓶中进行，且存在微载体价格昂贵、重复利用效果差、细胞制备需求量过大等缺点。全悬浮细胞培养具有细胞密度大、放大倍数大、传代方便等优势，但对各种培养条件也有较高要求。无血清培养是用已知的人源或者动物源蛋白或生长因子、激素来代替动物血清的一种培养方式，可降低后期纯化工作难度，提高产品质量[2]。驯化一株可适应普通摇瓶的全悬浮细胞可推进细胞培养工艺的进一步升级。全悬浮细胞驯化技术已在一些细胞中得到广泛应用。阿尔祖古丽·阿依丁等[3]对Marc-145 P50 代细胞进行无血清悬浮培养48 h 后，发现细胞密度可达到4.14×106cells/mL；刘天伦等[4]使用3 种培养方法驯化，将PK15 细胞从复苏到最终驯化成全悬浮细胞，传代23 个代次，发现细胞状态良好；王嘉琪等[5]通过梯次降低血清添加量，逐步多代次适应，使ST 细胞由贴壁转为悬浮，并能在无血清培养基中稳定传代，在反应器中高密度悬浮生长。本研究对一株贴壁ST 细胞在只通过1 个低血清滴度添加量适应培养后，进行无血清全悬浮驯化，并对猪伪狂犬病毒（PRV）在ST 悬浮细胞上的敏感性进行分析，以期为大规模培养PRV、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪瘟病毒等提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 ST 细胞株，购自湖南丰晖生物科技有限公司；PRV sx-gE 毒株，由上海市农业科学院畜牧兽医研究所课题组保存。

1.1.2 试剂及耗材 新生牛血清（NBS）、胰酶、DMEM，购自GIBCO 公司；ST-A 低血清培养基、ST-S 细胞无血清培养基，购自上海源培生物科技股份有限公司；T-75 细胞瓶、125 mL Erlenmeyer Flask 摇瓶，购自CORNING 公司；无血清细胞冻存液，购自新赛美生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 轨道式振荡器，购自杭州奥盛仪器有限公司；CO2培养箱，为Thermo 公司产品；Retiga2000R 高敏感度冷荧光数码显微镜，为日本奥林巴斯公司产品。

1.2 ST 贴壁细胞低浓度血清适应驯化

当贴壁培养的ST 细胞在含有10% NBS 的DMEM 培养液中稳定生长至汇合率达80%左右时，弃去培养液，加入适量PBS 溶液洗涤3 遍；加入适量胰酶，于CO2培养箱内作用片刻后弃掉胰酶消化液，37 ℃孵育，在显微镜下观察到细胞变圆缩后轻拍瓶底解离细胞；加入5 mL ST-A 低血清培养基（含1% NBS）重悬细胞，将细胞移植至T-75细胞瓶内培养；当ST 细胞汇合率达80%左右时，以低血清培养基（含1% NBS）连续传两代。

1.3 ST 细胞无血清悬浮培养

将适应了ST-A低血清培养基培养的ST细胞，移植至125 mL 摇瓶中进行悬浮培养驯化；将摇瓶安置在振荡器（转速设置为130 r/min）上，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行悬浮传代培养。

1.3.1 ST 细胞无血清全悬浮驯化 将在细胞瓶中低血清培养的ST 贴壁细胞用胰酶消化，以10 mL ST-S 无血清培养基重悬，1 000 r/min 离心5 min；弃上清，再用5 mL ST-S 无血清培养基重悬，取样计数细胞密度；将细胞密度稀释至1.00×106cells/mL，然后接种至带通气盖的125 mL 摇瓶内震荡培养，每24 h 取样计算细胞密度和活率。

1.3.2 驯化ST 细胞无血清悬浮培养传代 在驯化的ST 细胞密度达到3.00×106cells/mL 以上或者已悬浮培养48 h 时，以1.00×106cells/mL 的细胞密度进行细胞传代。当连续传代3 代以上，细胞悬浮培养48 h 均能到达3.00×106cells/mL 以上，且细胞活率不低于90%，则判定细胞适应了悬浮培养。

1.3.3 ST 细胞悬浮培养连续传代 取适应了悬浮培养的第5 代ST 细胞，以细胞密度1.00×106cells/mL进行连续传代，观察第10、15、20、25 代次细胞培养48 h 后的生长情况。

1.4 ST 悬浮细胞保存和复苏

1.4.1 ST 悬浮细胞保存 将悬浮培养的第5 代ST 细胞按照常规方法收集于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去离心管中的上清液，收集细胞沉淀；加入适量无血清细胞冻存液于离心管中，使细胞终密度在2.00×107cells/mL 以上。混匀细胞后，制成细胞混合液并均匀分装于冻存管中，每管1 mL，做好标记；直接将分装好的细胞冻存管置于-80 ℃超低温冰箱长期冷冻保存，进行细胞稳定性传代验证。

1.4.2 ST 悬浮细胞复苏 将冷冻保存2 周后的第5 代细胞冻存管从-80 ℃超低温冰箱取出，40 ℃水浴解冻；常温下1 000 r/min 离心5 min，去除上清后用适量ST-S 无血清培养基重悬，取样计数细胞密度；将细胞稀释至初始密度为1.00×106cells/mL，然后接种至摇瓶内震荡培养，观察细胞生长情况。

1.5 ST 悬浮细胞接毒试验

取适应悬浮培养的第10 代ST 细胞，将细胞密度调整至2.00×106cells/mL，将摇瓶安置在振荡器（转速设置为130 r/min）上，并置于37 ℃、5% CO2培养箱中悬浮培养；然后将PRV sx-gE 毒株病毒液按照感染复数为1.0（MOI=1）的量加至摇瓶内，震荡培养72 h 并收获病毒液；将病毒液反复冻融3 次后，接种至同样密度的ST 悬浮细胞中继续盲传培养，如此反复接毒培养并收获。当连续传代3代以上，且毒价在72 h能达到9.0 TCID50/mL时，判定此PRV sx-gE 毒株适应了悬浮培养。

1.6 细胞密度和TCID50 测定

本研究中的细胞密度测定是在取样后立即开展细胞计数，具体为用含10 g/L 结晶紫的柠檬酸溶液染色，以血细胞计数板对细胞计数，其中细胞活率=活细胞数÷（活细胞数+死细胞数）×100%。TCID50测定按照常规方法进行。

2 结果与分析

2.1 ST 贴壁细胞低浓度血清培养情况

由表1 可知，两次细胞传代培养，当细胞汇合率在80%时，ST 细胞可扩增至2.00×106cells/mL及以上，表明ST 贴壁细胞能适应ST-A 低血清培养基（含1% NBS）培养。

表1 ST 贴壁细胞低血清培养密度情况

2.2 ST 细胞无血清悬浮培养驯化

结果（表2）显示，在初始接种密度1.00×106cells/mL，培养48 h 后，自传至第3 代起，ST 细胞最终培养密度能达到3.00×106cells/mL 及以上，比第1 代和第2 代都高，且细胞活率高于90%，表明此细胞基本适应了悬浮培养。

表2 ST 细胞悬浮无血清的驯化密度情况

2.3 ST 悬浮细胞连续传代培养

结果（图1）显示，以细胞密度1.00×106cells/mL 进行连续传代培养，第10、15、20、25代次细胞分别悬浮培养48 h 后，最终细胞密度均可达4.20×106cells/mL 以上，高于3.00×106cells/mL的判定标准，且每代细胞密度值及活率较稳定，表明此ST 悬浮细胞株可以连续传代培养。

2.4 复苏细胞培养

复苏冻存的第5 代细胞进行悬浮培养，发现ST 细胞生长稳定，培养48 h 后最终细胞密度可达4.50×106cells/mL；之后，随着培养时间增加细胞活率有所降低（表3）。在显微镜下观察复苏后悬浮培养24、48、72、96 h 的细胞形态，可发现ST细胞轮廓清晰、分散均匀、大小均一性良好（图2）

表3 复苏细胞连续培养情况

2.5 PRV 在ST 悬浮细胞中的增殖

如表4所示：2.00×106cells/mLST悬浮细胞接种PRV sx-gE 毒株后，PRV 毒价随着盲传代次增加逐步提高，培养至第5 代时毒价达到109.0TCID50/mL，且继续接种培养至第7 代，病毒毒价均为109.00TCID50/mL 及以上，初步表明PRV sx-gE 毒株可在ST 悬浮细胞中培养增殖。

表4 不同代次PRV 在ST 悬浮细胞中增殖能力比较

3 讨论

细胞传代稳定性研究主要是评估细胞在连续传代后其生长特性是否发生改变，这也是评估细胞可否应用于疫苗生产的重要的、必不可少的部分[6]。本试验结果显示，连续传代培养25 代次，每隔5 代次悬浮培养48 h 测得最终细胞密度均达到4.20×106cells/mL 以上，并保持较高的活率，与陈宏等[7]研究结果相似。

细胞在培养过程中如果营养缺乏会导致细胞过早进入维持期并逐渐死亡，特别在细胞高密度培养工艺中，营养是制约细胞培养密度高低的重要因素。本试验显示，培养48 h 后最终细胞密度可达4.50×106cells/mL。之后，随着培养时间增加细胞活率有所降低，这可能是因单位体积内细胞培养所需营养不够而导致。因此，应根据实际生产中不同细胞株的生长代谢特性及病毒增殖需要，开发特定的低血清与无血清培养基。本研究用商品化专门适用于ST细胞驯化的ST-A 低血清培养基，只进行两代次细胞传代，培养细胞都扩增到2.00×106cells/mL 以上，表明ST 贴壁细胞快速适应了ST-A 低血清培养基（含1% NBS）。用ST-S 无血清培养基培养3 代后，细胞所能达到最终密度为3.00×106cells/mL以上，且细胞活率高于90%。

同一种病毒对同一细胞不同克隆株的敏感性不同，同一细胞所处外环境不同，同一病毒的敏感性也会有所差异[8]。本研究显示，将适用于贴壁ST 细胞的PRV 毒株接种至悬浮ST 细胞，随着盲传代次增加，其逐步适应在ST 悬浮细胞增殖且毒价有所提高，培养5 代后PRV 毒价达到109.00TCID50/mL，之后连续培养毒价都在109.00TCID50/mL 及以上，初步表明PRV sx-gE 毒株适应了在ST 悬浮细胞中培养增殖。

综上所述，通过选择专用培养基和自主驯化，可使ST 细胞由贴壁转为悬浮，并能在专用无血清培养基中稳定传代，在摇瓶中高密度悬浮生长，且PRV 适宜在ST 悬浮细胞中培养。