陈贞明
(福建片仔癀化妆品有限公司,福建漳州,363000)
蔓荆子(Vitex trifoliaL.)是我国传统中药,为马鞭草科植物单叶蔓荆的果实,在最早的药学专著《神农本草经》就有所记载。主要产于我国山东、江西、浙江等地。秋季果实成熟,晒干、去净杂质作为临床中药使用,味辛,苦,性微寒,能疏散风热,清利头目。单叶蔓荆的化学成分主要是黄酮类、二萜类、木脂素类、环烯醚萜类等,其中黄酮类含量最高[1]。单叶蔓荆中的黄酮类成分具有抑菌活性、抗炎活性,可镇痛、舒张血管等;二萜类成分具有抗氧化活性、细胞毒活性等,还有一些其他化学成分的功效也逐步得到研究。因此,单叶蔓荆具有较广泛的药理作用,具有解热镇痛、抗炎、抗肿瘤、降血糖[2-5]等作用。
蔓荆子黄素属于多甲氧基黄酮类化合物,是单叶蔓荆的主要黄酮类成分,具有抗肿瘤、抗炎、舒张血管、抑菌等作用[6-9]。蔓荆子黄素在干燥成熟果实中含量最高,比干燥叶片含量高约40%[10];不同的炮制方法对药材中蔓荆子黄素的含量也有所影响,其中酒浸烘制可使其含量最高[11]。相关文献指出,生品蔓荆子经过炮制后黄酮类成分含量有所下降,水溶性浸出物增加,除了参考蔓荆子黄素含量,还应结合高效液相色谱法或其他方法反映蔓荆子炮制质量,进一步揭示蔓荆子的炒制科学内涵[12]。
Waters e2695 高效液相色谱仪(美国Waters 公司);UTP-313 型电子天平(上海花潮电器有限公司);KQ—210A 型超声波清洗仪器(昆山市超声仪器有限公司);FSJ-A03D1 小型粉碎机(小熊电器股份有限公司);RE-52AA 旋转蒸发仪器(苏州赛恩斯仪器有限公司);SHB-IIIA 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)
蔓荆子(亳州市弘宝堂商贸有限公司);蔓荆子黄素对照品(分析标准品≥99.5%,阿拉丁);甲醇(北京生化科技有限公司);乙腈(北京生化科技有限公司);乙醇(南京化学试剂有限公司)
采用乙醇回流法提取蔓荆子中蔓荆子黄素。准确称取100 g 蔓荆子药材,放入小型粉碎机粉碎。料液比1∶15,分两次提取,向圆底烧瓶中加入30%乙醇,置于电热套连接冷凝器进行热回流提取,每次提取时间为3 h。提取后溶液放置室温后过滤,3500 r/min离心15 min后抽滤,得到上清液即为蔓荆子提取液。将蔓荆子提取液放入旋转蒸发仪器减压回收溶剂直至浸膏,放入真空干燥箱烘干后得到蔓荆子提取物。提取物中加入适量甲醇配置成0.1 mg/mL蔓荆子溶液,过0.22µm有机膜过滤备用。
取蔓荆子黄素对照品适量,加甲醇定容至25 mL 棕色量瓶中,摇匀,制得质量浓度为0.1 mg/mL的蔓荆子黄素储备液。
色谱柱选择 Aglient C18 柱(250 mm × 4.6 mm,5 µm),流动相为甲醇-体积分数0.05%磷酸(体积比70∶30)。检测波长为322 nm,流速为1.0 mL/min,进样量为20µL,柱温为30 ℃。见图1。
图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance
将蔓荆子黄素母液稀释成 12.5、25、50、100、200 µg/mL,精密吸取20 µL,按照2.3 项下的色谱条件进样分析。以蔓荆子黄素进样的浓度为横坐标,以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线,并计算出蔓荆子黄素的线性回归方程为Y = 1.42× 104X - 2.172×102,R2=0.9997。结果表明,蔓荆子黄素的浓度范围在12.5~200µg/mL,其峰面积与进样的浓度具有良好的线性关系。见图2。
图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of test article
取供试品溶液,按色谱条件进样20µL,重复进样6次,记录色谱图,记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素的RSD 为0.71%(n = 6),小于3.0%,表明该方法的精密度良好。
按2.2 项下方法新配制蔓荆子供试品溶液,室温下放置,分别在 0、2、4、6、8、10、12 h 进样,记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素RSD为1.05%(n = 7),小于3.0%,结果表明本蔓荆子供试品溶液在12 h内保持稳定,表明该方法稳定性良好。
取蔓荆子粉末6 份,分别按2.2项下实验方法配制溶液,按色谱条件进行分析,记录蔓荆子黄素的峰面积。计算蔓荆子黄素的RSD 为0.96%(n=6),小于3.0%,表明该方法重复性良好。
分别精密吸取2.2 项下蔓荆子黄素对照溶液2、2、3、3、4、4 mL,置于20 mL 容量瓶中,挥干,取 6 份已知含量的供试品溶液加入容量瓶中,加入甲醇溶液稀释至刻度,取20 µL 分别注入高效液相色谱仪器中。按照色谱条件,测定蔓荆子黄素含量,并计算加样回收率,结果见表一。
表1 蔓荆子黄素加样回收率试验结果Table 1 Test results of sample recovery of vitexin
取3 批蔓荆子药材,精密称定,按照2.2 项下制成供试品溶液,按照色谱条件进行测定。根据标准曲线计算蔓荆子中蔓荆子黄素的含量,结果见表2。
表2 不同编号蔓荆子样品中蔓荆子黄素含量Table 2 Content of vitexin in Vitex trifolia samples with different numbers
蔓荆子化学成分复杂,其黄酮类、萜类等主要成分在多个方面具有治疗功效。通过对蔓荆子的化学成分进行分析,发现蔓荆子黄素对齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等疾病具有明显的治疗作用,表明其临床应用具有很大的潜能性。
本试验通过对高效液相色谱条件的优化,得出了较好的蔓荆子黄素的出峰时间,并判断出了在254 nm 处有最好的吸收效果,因此选择254 nm作为高效液相色谱的检测波长。试验通过对蔓荆子黄素标准品溶液进样,进行梯度洗脱以确定试验中流动相的大体比例,后采用等度洗脱对流动相的比例进行调整,进一步选择最适合于该试验的流动相比例,来达到优化的目的,使试验的结果更加准确。