青砖茶多糖含量测定条件的响应面法优化研究

王世越，王自瑶，柯钦豪，谢文静，周宏福，王 彩，郑 敏

(湖北科技学院，湖北 咸宁 437100)

青砖茶属黑茶系，主产于鄂南地区，湖北省咸宁市是其主产区之一，现已有六百多年的生产历史[1]。传统的青砖茶使用老青茶为原料，经相应的制作工艺流程处理后，得到的青砖茶外表色泽青褐，其茶汤色泽明亮偏红，味道醇厚。目前已有研究发现青砖茶具有一些保健功效，如：减肥降脂[2-3]、改善胃肠道功能[4-5]、抗氧化[6-7]及抑菌[8]等功能。青砖茶多糖为青砖茶中主要的功能成分之一，具有抗氧化性[9]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[10]等功能。因此，青砖茶多糖中糖含量的准确测定对青砖茶多糖今后的研究具有重要的影响。

多糖是一类广泛存在于自然界的天然大分子物质[11]，常用的多糖含量检测方法有苯酚浓硫酸法、蒽酮硫酸法、高锰酸钾滴定法等[12]。苯酚浓硫酸法因操作简单且灵敏的优点被广泛应用，其原理是通过强酸加高温的条件下将多糖水解为单糖，单糖在该环境下迅速脱水生成糖醛衍生物，进一步与苯酚结合，生成显色物质，通过紫外分光光度计对其进行检测，在490nm波长附近具有最大吸收峰[13]。

通过苯酚浓硫酸法进行多糖含量测定时，测定结果受多糖组成、浓硫酸用量以及苯酚用量的影响[14]。所以，为使测定结果更为准确，需对该方法进行条件优化。本实验以青砖茶为原材料，使用苯酚浓硫酸法测定青砖茶多糖的含量，确定其最大吸收波长，优化静置时间、水浴时间、水浴温度、苯酚用量、浓硫酸用量5个影响因素，并进一步采用响应面法进行优化。对优化后方法进行精密度、稳定性、重复性以及加样回收率等进行考察，旨在建立青砖茶多糖含量的最佳测定方法。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

青砖茶(湖北赤壁赵李桥茶业有限公司)、浓硫酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、苯酚(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)、葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、石油醚(分析纯，麦克林试剂有限公司)、乙醇(95%，麦克林试剂有限公司)、聚酰胺粉(分析纯，阿拉丁试剂有限公司)。

紫外分光光度计(A360型，翱艺仪器有限公司)、水浴锅(HH-S型，常州市瑞华仪器制造公司)、高速离心机(TGL-20M型，湖南沪康离心机有限公司)、集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S型，上海辰邦西仪器科技有限公司)、真空干燥箱(DZ-1BC1V型，天津泰斯特仪器有限公司)、旋转蒸发仪(N-1300型，EYELA有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的配制

准确称量青砖茶粉末(过80目筛)20g，放置于三颈烧瓶中，按料液比1∶10加入石油醚，60℃下加热3h除色素，取茶渣60℃下干燥至恒重。将茶渣放置于三颈烧瓶中，按料液比1∶10加入80%的乙醇溶液，80℃下加热2h除小分子，取茶渣80℃下干燥至恒重。取茶渣按料液比1∶16加入超纯水，60℃下水提4h，将水提液在5 000r/min下离心15min，重复两次，取其上清液。将上清液旋蒸浓缩至20mL，加入60mL无水乙醇，4℃过夜，8 000r/min下离心15min，取沉淀，冷冻干燥，得青砖茶初多糖。取1.0g青砖茶初多糖，配制为10mg/mL的多糖溶液，过聚酰胺柱除蛋白质与色素，收集洗脱液，浓缩后透析48h，冷冻干燥得精制青砖茶多糖[15-17]。取0.1g精制青砖茶多糖，加入定容于100mL的容量瓶中，摇匀得样品溶液。

1.2.2 对照品溶液的配制

精密称量D-葡萄糖0.100 0g，加水定容于100mL的容量瓶中，摇匀得对照品溶液。

1.2.3 最大吸收波长的确定

吸取1.2.1步骤中样品溶液0.8mL，置于离心管中，加入5%苯酚0.8mL、浓硫酸4mL，室温下避光静置10min，30℃下水浴加热25min。以纯水为空白对照，重复以上步骤，在紫外分光光度计下400～600nm波长段扫描波长图谱。

1.2.4 显色条件的优化

(1)苯酚用量。精密移取青砖茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞试管中，分别加入5%的苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，混匀后加入浓硫酸4mL，摇匀后在30℃下水浴25min，取出后待其冷却至室温，测定吸光度。每组以纯水为空白对照，加入不同量的苯酚溶液，重复上述流程。重复实验3次。

(2)浓硫酸用量。精密移取青砖茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞试管中，分别加入5%的苯酚溶液0.8mL，混匀后分别加入浓硫酸3、4、5、6、7mL，摇匀后在30℃下水浴25min，取出后待其冷却至室温，测定吸光度。每组以纯水为空白对照，加入不同量的浓硫酸溶液，重复上述流程。重复实验3次。

(3)静置时间。精密移取青砖茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混匀后加入浓硫酸4mL，静置10、20、30、40、50min，每组以纯水为空白对照，静置不同时间，测定吸光度。重复实验3次。

(4)水浴温度。精密移取青砖茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混匀后加入浓硫酸4mL，分别在30、40、50、60、70、80℃下水浴25min，每组以纯水为空白对照，不同温度下进行水浴，测定吸光度。重复实验3次。

(5)水浴时间。精密移取青砖茶多糖溶液0.8mL于10mL的具塞试管中，加入5%苯酚溶液0.8mL，混匀后加入浓硫酸4mL，在30℃下分别水浴15、25、35、45、55min，每组以纯水为空白对照，水浴加热相应的时间，测定吸光度。重复实验3次。

1.2.5 苯酚浓硫酸法响应面实验

在单因素实验的基础上选择对吸光度结果影响较大的条件：苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度3个因素为自变量。使用软件Design-expert 8.0.6进行Box-Behnken实验设计，对苯酚浓硫酸法测定青砖茶多糖含量进行条件优化。实验设计因素、水平如表1所示。

表1 Box-Behnken实验因素与水平表

1.3 方法学验证

1.3.1 标准曲线的绘制

精密移取不同浓度的对照品溶液各0.8mL于10mL具塞试管中，按优化后的条件进行显色操作，测定最大吸收波长处的吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 重复性考察

精密移取5份多糖溶液0.8mL于10mL具塞试管中，按优化后的条件进行显色操作，测定最大吸收波长处的吸光度，求RSD值。

1.3.3 精密度考察

精密移取多糖溶液0.8mL于10mL具塞试管中，按优化后的条件进行显色操作，在最大吸收波长处连续测定5次，求RSD值。

1.3.4 稳定性考察

取1.3.3中溶液，在放置5、15、25、35、45min后，在最大吸收波长处进行吸光度测定，求RSD值。

1.3.5 加样回收率实验

精密吸取4份青砖茶多糖溶液0.8mL，一份做为对照品，另外3份加入不同重量的葡萄糖，按照优化后的方法优化以上溶液，测试最大波长处吸光度。吸取0.8mL纯水，按优化后方法进行显色操作，作为空白对照。

1.4 数据处理

本试验采用origin软件进行数据的处理及绘图。

2 结 果

2.1 最大吸收波长

青砖茶多糖400～600nm波长扫描图见图1。可知，青砖茶多糖紫外最大吸收峰在487nm处。

图1 青砖茶多糖紫外吸收光谱

2.2 显色条件的优化

2.2.1 苯酚用量

苯酚用量与吸光度的关系，见图2。实验结果显示：当加入5%苯酚量0.4～0.6mL，吸光度随苯酚的量增加而增加；当苯酚量大于0.6mL，吸光度下降。说明苯酚在合适的用量下可达到最佳的显色效果，根据实验结果选择0.6mL的苯酚作为显色条件。

图2 不同苯酚量下的吸光度(n=3)

2.2.2 浓硫酸用量

浓硫酸用量与吸光度的关系，见图3。实验结果显示：当加入浓硫酸3～5mL，吸光度随苯酚的量增加而增加；当浓硫酸量大于5mL，吸光度下降。说明浓硫酸在合适的用量下可达到最佳的显色效果，根据实验结果选择5mL的浓硫酸作为显色条件。

图3 不同浓硫酸量下的吸光度(n=3)

2.2.3 静置时间

静置时间与吸光度关系，见图4。实验结果显示：静置10～30min，吸光度随时间的增加而上升，30min后，吸光度趋于稳定。因此，选择30min作为最佳的静置时间。

图4 不同静置时间下的吸光度(n=3)

2.2.4 水浴温度

水浴温度与吸光度的关系，见图5。实验结果显示：水浴温度30℃～60℃，吸光度随温度的增加而上升；当温度大于60℃，吸光度开始下降，推测是过高的温度导致显色物质分解。因此，选择60℃作为最佳显色温度。

图5 不同水浴温度下的吸光度(n=3)

2.2.5 水浴时间

不同水浴时间下的吸光度，见图6。实验结果显示：水浴15～25min，吸光度随水浴时间的增加而升高，温度大于25min后，吸光度下降，推测是由于水浴时间过长导致显色物质分解。根据实验结果选择25min作为水浴时间。

图6 不同水浴时间下的吸光度(n=3)

2.3 响应面实验结果

2.3.1 响应面实验设计及结果

使用软件Design-expert 8.0.6进行Box-Behnken实验设计，实验结果见表2。

表2 Box-Behnken设计实验结果

2.3.2 响应面实验模型及方差分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行拟合分析，得回归方程模型：y=3.14+0.028A+0.062B-0.007 125C+0.032AB+0.076AC-0.042C-0.089A2-0.100B2-0.056C2。见表3。

表3 响应面实验模型方差分析

响应面图中图像陡峭程度代表影响程度，越陡峭代表影响越高。绘制不同因素之间的交互作用图，如图7(封二)所示。

结合实验方差结果与响应面图分析，可得出三个因素的影响大小分别为：浓硫酸用量>苯酚用量>水浴温度。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析，得到苯酚-硫酸法测定青砖茶多糖含量的最佳条件为：苯酚用量0.62mL，浓硫酸用量5.36mL，水浴温度59.32℃，在此条件下预测吸光度为3.153 65。考虑到实际操作因素，将最佳条件调整为：苯酚用量0.6mL，浓硫酸用量5mL，水浴温度60℃。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线如图8，葡萄糖标准溶液与吸光度之间的线性回归方程为y=5.923 7X+0.063 9，R2=0.996 7，说明该方法下葡萄糖在浓度0.1～0.5mg/mL下呈现良好的线性关系。

图8 葡萄糖标准曲线

2.4.2 重复性考察

由表4显示，通过5次重复性实验，相对标准偏差RSD为1.07%，表明该方法重现性好。

表4 重复性实验

2.4.3 精密度考察

由表5显示，通过5次精密度实验，相对标准偏差RSD为0%，表明该方法精密度好。

表5 精密度实验

2.4.4 稳定性实验

由表6显示，通过5次稳定性实验，相对标准偏差RSD为0.15%，表明该方法稳定性好。

表6 稳定性实验

2.4.5 加样回收率

表7显示，该方法加样回收率97.22%～99.22%，相对标准差RSD为0.87%，说明该方法具有良好的回收率，且较为稳定。

表7 加样回收率

3 结 论

通过控制变量法分析了苯酚浓硫酸法中各个因素对测定青砖茶多糖吸光度的影响，得到了测定青砖茶多糖含量的最佳单因素条件，通过响应面法进一步优化，得到最佳的测定条件。实验结果显示：最佳测定条件为在0.8mL的多糖溶液中加入0.6mL的5%苯酚溶液，匀速缓慢加入5mL浓硫酸溶液，静置30min后，在60℃的温度下水浴25min，冷却后在487nm处测定其吸光度。该方法在0.1～0.5mg/mL具有良好的线性关系，重复性、稳定性好，精密度高，且回收率良好，可将该方法作为青砖茶多糖测定的最佳方法。