蒸汽爆破技术对杜仲木脂素类成分的影响

潘梦华 苏亚菲 李 桑 李 涛 王志芳 白孟鑫 张瑶新李 钦丁艳霞*孙志强

1.河南省杜仲栽培与利用工程实验室，河南 开封 475000；2.河南大学 民生学院，河南 开封 475000；3.国家林业局泡桐研究开发中心，郑州450000

0 引言

杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥树皮，是中国传统药材，在我国有两千多年的用药历史。《神农本草经》中将其列为上品，性温，味甘，归肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，安胎的功效。用于治疗肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安等［1］。杜仲中的化学成分主要有黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、酚酸类、萜类、甾体类和多糖类等。具有降压、调节血脂、降血糖、抗炎、肝保护和抗肿瘤等药理作用，广泛应用于中医临床复方及多种中成药中［2］。

蒸汽爆破简称汽爆，是一种新兴的生物质预处理技术。其原理是通过将渗进植物组织内部的蒸汽分子瞬时释放完毕，使蒸汽内能转化为机械能并作用于生物质组织细胞层间，从而用较少的能量将原料分解。蒸汽爆破预处理是木质纤维原料转化领域最有前景的预处理技术之一，具有能耗低、环境友好等优点［3］。由于杜仲各部位均富含杜仲胶，胶丝严重干扰杜仲活性成分的溶出，因此，考虑利用爆破预处理技术破坏杜仲复杂的结构，打开活性成分溶出的通道。已经有研究［4］表明，杜仲采用爆破预处理后，明显提高了杜仲黄酮和绿原酸的得率。但是，对于有明显药效活性的木脂素类成分的变化，目前尚未涉及。本研究主要考察蒸汽爆破预处理工艺条件对杜仲木脂素类成分的影响。

1 材料

1.1 药材

杜仲树皮和杜仲叶：样品信息及处理方法见表1。

表1 样品信息表

1.2 对照品

松脂素二糖苷（批号：DST191025⁃013，含量≥98%）、松脂素（批号：DST190115⁃208，含量≥98%）、丁香脂素二糖苷（批号：DST⁃200413⁃055，含量≥98%）、丁香脂素（批号：DST200515⁃171，含量≥98%）、中脂素（批号：DST190326⁃084，含量≥98%）均购自成都德思特生物科技有限公司，中脂素二糖苷（批号：20031903，含量≥98%）购自成都普菲德生物技术有限公司。

1.3 试剂

甲醇（天津市四友精细化学品有限公司），乙腈（天津市四友精细化学品有限公司），均为色谱级。磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），浓硫酸（中国平煤神马集团开封东大化工有限公司），变色酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.4 仪器

LC⁃20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津），紫外分光光度计（岛津UV⁃2600），M150A 型分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多仪器有限公司），SB⁃5200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），

2 方法

采用紫外分光光度法测定杜仲爆破前后总木脂素的含量［5］。高效液相色谱法测定木脂素主要成分丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的含量。

2.1 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末0.4 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，加入后加盖密塞，称定重量，超声30 min，冷却后再次称定重量，用甲醇补足重量，抽滤，取滤液1 mL 于5 mL 容量瓶中用甲醇定容，摇匀，过0.22 μm 的微孔滤膜，即得。

2.2 对照品溶液的制备

取丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素对照品适量，精密称定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，定容，摇匀，制成每1 mL 含丁香脂素二糖苷0.007 5 mg、松脂素二糖苷0.003 25 mg，中脂素二糖苷0.005 mg，丁香脂素0.001 75 mg、松脂素0.002 75 mg、中脂素0.004 mg的混合对照品，保存于4 ℃冰箱中，备用。

2.3 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18 色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表2 进行梯度洗脱。流速为1.0 mL／min，检测波长为227 nm，进样量：10 μL，柱温：30 ℃。

表2 梯度洗脱程序表

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的绘制

分别精密吸取混合对照品溶液1、3、5、8、10、20、30、40 μL，按2.3 项下色谱条件进样测定，记录其峰面积。以进样量（X／μL）为横坐标，色谱峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程见表3。

表3 回归方程、相关系数和线性范围

2.4.2 精密度试验

精密量取混合对照样品1 mL，按2.2.3 项下色谱条件连续进样5 次，丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的峰面积的RSD 分别为0.97%、1.00%、0.81%、1.70%、0.88%、0.91%，表明此仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验

精密称定同一批样品（样品3）粉末5 份，每份约0.4 g，按2.2.1 项下方法制备供试样品溶液，按2.3项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的峰面积的RSD 分别为1.80%、2.84%、1.50%、2.42%、2.46%、2.45%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

精密称取样品（3 号）5 份，按2.2.1 项下方法制成供试样品溶液，按2.2.3 项下色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24 h 进样10 μL，结果样品中丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的RSD 值分别为0.38%、1.26%、1.35%、0.95%、1.28%、2.05%，表明供试样品溶液在24 h 内基本稳定。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的杜仲样品（10 号）粉末6份，每份约0.4 g，置于50 mL 量瓶中，分别加入对照品适量，按2.1 项下方法制成供试品，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。

3 结果

3.1 预爆破前后总木脂素含量

为探究蒸汽爆破预处理对杜仲皮木脂素类成分的影响，按照1.1 项下各样品的处理条件对杜仲进行处理，按照2.1 项下的方法制成供试品，采用2.1项下方法测定杜仲总脂木素含量，重复三次，取平均值，结果见表5。

表5 样品总木脂素含量测定结果（n＝3）

3.2 预爆破前后木脂素主要成分含量测定结果

分别取样品0.4 g。按2.1 项下方法制成供试样品溶液，按2.3 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，色谱图见图1、图2 和图3。根据标准曲线计算各样品中丁香脂素二糖苷、松脂素二糖苷、中脂素二糖苷、丁香脂素、松脂素、中脂素的含量，重复三次，取平均值，结果见表6。

表6 样品含量测定结果（单位：mg／g）（n＝3）

图1 生品杜仲高效液相色谱图

图2 蒸汽爆破后杜仲高效液相色谱图

图3 标准品高效液相色谱图

表4 加样回收率实验（n＝6）

4 讨论

依据表5 结果可以看出，汽爆后总木脂素含量均明显降低。对比汽爆后样品4、5 的含量发现，汽爆前球磨和剪碎使原料比表面积增大，汽—质接触充分，有利于木脂素类成分的溶出，汽爆后再球磨和剪碎，对于有效成分的溶出，各样品间无显著性差异。

对比1、4、5 和2、6、7、8、9 样品中各成分含量测定结果发现，样品在爆破前球磨，木脂素苷成分下降比未球磨的更明显，苷元含量的上升也很明显，但是二者之间不成完全对应关系。说明木脂素苷类成分在爆破后并没有完全定向转化为其苷元。蒸汽爆破后杜仲（图2）的色谱峰数量明显多于生品杜仲，说明杜仲经强力爆破后，化合物中的化学键有可能发生了断裂和重排，有新的物质生成。

空气-蒸汽爆破预处理破坏了样品的纤维网络和细胞壁，改善了提取过程中溶质-溶剂的可及性和内部传质。植物材料蒸汽爆炸的典型结果包括木质纤维素结构的大量分解、半纤维素化合物的水解和木质素化合物的解聚［6］。细胞壁在高压蒸煮过程中，高压空气和蒸汽渗入物料，水解反应导致细胞壁中的多糖降解和解聚。在压力突然释放过程中，样品会受到水热效应和撕裂力的联合作用。因此，保留时间与植物原料的水解和汽-水介质的扩散有关，这对植物的预处理效率和提取率都有重要影响［7⁃8］。依据表6 各木脂素测定结果可以看出，木脂素苷的含量爆破后明显降低，其相对应的苷元含量却有不同程度的升高。出现这一现象的原因可能为木脂素苷的糖苷键受到撕裂和水热效应发生断裂，生成对应的苷元。

观察样品6、8、9 和7 的总木脂素含量发现压强在1.6 MPa 时，总木脂素含量较高，而当压强升高变为1.8 MPa 时，总木脂素含量反而降低，说明1.6 MPa 是杜仲木脂素爆破的最佳压强。进一步对比样品2、6、7、8、9 中松脂素二糖苷和松脂素的数据发现，在压强为1.6 MPa 时松脂素二糖苷几乎能定向的脱糖转化为松脂素，如样品6（汽爆前未球磨，爆破压强1.6 MPa，爆破时间300 s）松脂素二糖苷定向转化为松脂素，其转化率60.75%。样品7（汽爆前未球磨，爆破压强1.6 MPa，爆破时间220 s）的转化率为68.96%，样品8（汽爆前未球磨，爆破压强1.6 MPa，爆破时间180 s）的转化率达到78.21%。当压强高于1.6 MPa，如样品9（汽爆前未球磨，爆破压强1.8 MPa，爆破时间300 s）的转化率降为47.41%。说明松脂素二糖苷的最佳转化条件是爆破压强1.6 MPa，爆破时间180 s。但是在同样条件下，丁香脂素二糖苷和中脂素二糖苷的转化虽然有苷的降低和苷元含量的上升，但是未发现准确规律，说明不同的成分糖苷键的断裂所需要的能量也略有差异。

在萃取过程中，比表面积对活性物质的传质过程有重要影响过程。随着比表面积的增大，溶剂内扩散阻力降低，溶剂更容易到达萃取部位，提高萃取效率［7］。杜仲叶片和皮相比，对压力造成的比表面积增加更敏感。已经有研究［6］表明，杜仲叶片的比表面积随压力的增加先升后降，当压力达到1.0 MPa，比表面积达到最大，化合物的提取率也有相似的结果。所以，在采用和皮同样的压力（1.6 MPa，1.8 MPa ）时，叶片中木脂素含量反而更低。