细胞分裂周期蛋白20、微小RNA-34a-5p在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及与临床病理的相关性

葛新国 原小斌

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cancer，BUC)是膀胱癌常见形式[1],预后很差。细胞分裂周期蛋白20(cell division cycle protein 20，CDC20)可激活促进复合物(anaphase-promoting complex，APC/C)启动细胞分裂G2/M期。有证据表明，CDC20可能成为一个很有前途的肿瘤治疗靶点[2]。CDC20的异常表达可能会扰乱APC/C的激活。有研究报道了其在前列腺癌、肝细胞癌中过度表达[3]。miR-34a-5p上调表达后，可有效抑制人肺癌H460细胞的增殖，并促进其凋亡[4]。经miRTarBase网站预测发现,miR-34a-5p与CDC20存在结合位点。本研究检测BUC病人组织中CDC20、miR-34a-5p的表达，并分析二者与临床病理的相关性。

对象与方法

一、对象

2015年2月～2017年2月本院肿瘤科收治的BUC病人80例，均接受手术治疗，术中留取癌组织(BUC组)及相对应的癌旁组织(对照组，距离癌缘2.5 cm)。其中男56例，女24例，年龄43～79岁；组织学分级：高级别53例，低级别27例；发生在膀胱39例、肾盂27例、输尿管14例。纳入标准：(1)术后经病理切片证实为BUC；(2)术前未在本院或其他医院接受放疗、化疗或分子靶向治疗；(3)病历资料完整，有完整随访记录。排除标准：合并前列腺癌、肾细胞癌等其他癌症；有严重的心脑血管疾病、肝肾疾病；合并自身免疫性疾病。病人及家属知情并同意签字，本研究经本院道德伦理委员会批准通过。

二、方法

1.主要试剂与仪器：Trizol试剂(美国Invirotrogen公司)；反转录试剂盒(上海吉至生化科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；CDC20兔抗人一抗、羊抗兔IgG二抗(英国Abcam公司)；链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(Streptavidin-peroxidase linkage method，SP)试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司)；二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒(货号DAB002，合肥康源生物科技研究所)；实时荧光定量PCR仪(型号7300型，美国Applied biosygtems公司)；奥林巴斯显微镜(型号BX51、TSX40086V，日本奥林巴斯株式会社)；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

2.样品采集及保存：所有样本均为手术中切除新鲜组织样本，经10%甲醛固定4～6小时，梯度脱水，组织浸蜡，石蜡包埋，剩余组织保存于-80 ℃冰箱备用。

3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测BUC组织中CDC20 mRNA、miR-34a-5p表达水平。参照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，内参分别选用GAPDH、U6基因，CDC20 mRNA、miR-34a-5p、GAPDH、U6引物序列见表1。采用2-ΔΔCt方法计算BUC组织中CDC20 mRNA、miR-34a-5p相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

4.免疫组化法(S-P法)检测BUC病人组织中CDC20的表达：以出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。染色指数(staining index，SI)为阳性细胞表达百分比评分与着色强度评分乘积。

5.随访：通过门诊复查的方式进行随访，开始于2015年2月，每2～3个月随访1次，截至2020年2月。随访期间，有淋巴结转移16例；31例病人死亡(21例死于BUC，10例死于心血管疾病或意外等其他原因)；无失访。

三、统计学分析

结果

1.CDC20和miR-34a-5p水平：BUC组组织中CDC20 mRNA为(2.68±0.35)，对照组为(1.05±0.19)，miR-34a-5p分别为(0.42±0.08)和(1.08±0.11)，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.CDC20 mRNA和miR-34a-5p水平相关性：Pearson法分析显示，miR-34a-5p、CDC20 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.696，P<0.05)。

3.CDC20在癌旁正常组织及BUC组织中的表达：免疫组化结果显示，BUC组织中CDC20阳性率高于癌旁正常组织(76.25% vs 18.75%，χ2=53.033，P<0.05)。见图1。

图1 CDC20在癌旁正常组织及BUC组织中的表达(S-P法×200)

4.BUC组织中CDC20、miR-34a-5p表达与临床病理特征的关系：以SI<2为阴性表达，SI≥2为阳性表达，分为CDC20阴性组(19例)和阳性组(61例)；以BUC组miR-34a-5p表达平均值为界值，分为miR-34a-5p低表达组(41例)与高表达组(39例)。BUC病人中CDC20、miR-34a-5p表达与组织学分级、组织浸润、复发密切相关(P<0.05)，而与年龄、病变部位、淋巴结转移无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 BUC组织中CDC20、miR-34a-5p表达与临床病理特征的关系(例)

5.BUC组织中CDC20、miR-34a-5p表达水平与预后的关系：K-M法分析显示，BUC病人3年累积生存率为61.25%(49/80)，CDC20阳性表达病人3年累积生存率低于CDC20阴性表达病人(52.46% vs 94.74%，Log-rank χ2=9.318，P<0.05)；miR-34a-5p高表达病人3年累积生存率高于miR-34a-5p低表达病人(87.18% vs 48.78%，Log-rank χ2=13.434，P<0.05)。见图2。

图2 BUC组织中CDC20、miR-34a-5p表达水平与预后的关系

6.Cox回归分析BUC病人预后的影响因素：单因素Cox分析显示，病变部位、淋巴结转移、组织浸润、复发、CDC20、miR-34a-5p均是影响BUC不良预后的危险因素；多因素Cox分析显示，CDC20水平偏高、miR-34a-5p水平偏低是BUC不良预后的危险因素(HR=2.635、3.426，P<0.05)。见表3。

表3 Cox回归分析BUC病人预后的影响因素

讨论

BUC是膀胱癌的主要类型，为泌尿系统常见的恶性肿瘤[5]。BUC病人通常表现为无痛性血尿，诊断常被延误。目前，膀胱癌的疾病管理主要依赖于积极的治疗，以及根据疾病的分期和等级进行手术[6]。

有研究发现，CDC20在宫颈高级鳞状上皮内病变和鳞状细胞癌中上调[7]。CDC20的高表达与前列腺癌、口腔鳞状细胞癌、胃癌、结直肠癌和非小细胞肺癌的预后不良相关[2,8-10]。miRNA通过引起靶mRNA的降解或通过其特异性结合来抑制其翻译而充当基因表达的转录后调节子[11]。miR-34a包含miR-34a-3p和miR-34a-5p两种形式，其强表达可诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老，抑制上皮间质转化和肿瘤干细胞增殖[12]。miR-34a-5p来源于miR-34a，可以阻止肿瘤细胞的迁徙和侵袭[13]。本研究结果提示，CDC20、miR-34a-5p可能与BUC的发生有关。免疫组化结果表明，CDC20可能参与BUC的发病过程。BUC病人CDC20、miR-34a-5p表达与组织学分级、组织浸润、复发密切相关。提示二者可能参与了BUC的发生、发展过程，可能与CDC20高表达、miR-34a-5p低表达促进肿瘤生长有关。

Lee等[14]研究了上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma ，UTUC)，发现病人组织中317个差异表达的基因，神经轴突导向分子SLIT3的低表达是BUC病人生存率差异的预测因子，而miR-34a-5p是其潜在的调节因子，推断miR-34a-5p在UTUC中具有潜在的预后诊断价值。本研究经K-M法分析显示,CDC20、miR-34a-5p的异常表达与BUC病人生存率有关。Cox分析提示,CDC20、miR-34a-5p水平异常可能与BUC不良预后有关，具有潜在的诊断价值。

综上所述，BUC病人癌组织较正常组织中CDC20 mRNA和蛋白水平升高、miR-34a-5p水平降低。CDC20、miR-34a-5p与BUC组织学分级、淋巴结转移、组织浸润、复发及不良预后密切相关，具有潜在的诊断价值。本研究也存在未检测血清中CDC20、miR-34a-5p的水平的不足，所以对发生BUC的预测价值不足。