水钾耦合对苜蓿根颈抗氧化特性及越冬率的影响

孙明雪， 张玉霞*， 丛百明， 夏全超， 田永雷， 张庆昕， 张冬梅

(1.内蒙古民族大学农学院/内蒙古自治区饲用作物工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028041； 2. 内蒙古自治区通辽市畜牧兽医科学研究所， 内蒙古 通辽 028000； 3. 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010010)

随着国民生活水平的提高，我国畜牧业得到快速发展，对饲草品质和数量的要求越来越高。苜蓿(Medicagosativa)是全世界广泛种植的豆科饲用作物，是富含矿物质、蛋白质、维生素等的优质牧草[1]，其栽培管理技术十分重要。科尔沁地区属于温带大陆性季风气候，降雨主要集中在夏季，而我国北方地区的水资源严重短缺，农业灌溉水的利用率仅达到39%～50%[2-3]。水分在植物整个生命过程中发挥至关重要的作用，主要包括参与植物体内各种酶的生理生化反应、有机物的代谢等[4]。当植物受到干旱胁迫时，细胞的正常生命活动受阻导致活性氧大量积累，进而会引起抗氧化酶活性的变化，当超过植物的耐受范围后，会造成植物死亡[5-6]。钾是植物生命活动中不可缺少的大量元素之一，不仅高速透过生物膜，还与酶促反应密切相关，其中抗氧化清除系统中酶活性的启动就需要钾元素的参与[7-8]；也有研究表明钾肥有利于降低丙二醛含量[9]，促进含氮化合物向蛋白质合成场所运输[10]。水肥耦合是指将施肥和灌水融为一体以达到作物高品质高产的农业技术[11]，水分和钾肥都对植物生长有重要作用，两者之间即有相互协同[12]，又有相互拮抗的作用，一方面水分可以加速肥料的溶解，但水分过多时又会降低养分的浓度；而适度的钾肥可以减少水分蒸腾。目前，关于水肥耦合对其他作物生理特性方面的研究有很多，但关于水钾耦合对苜蓿抗寒生理特性影响方面的研究甚少，如何调节科尔沁沙地苜蓿越冬栽培管理中的水分和钾素，提高苜蓿抗寒特性，因此，本研究分析了不同水钾耦合处理下苜蓿根颈的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，过氧化氢酶(Catalase，CAT)，过氧化物酶(Peroxidase，POD)，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，可溶性蛋白(Soluble protein，SP)及越冬率(Winter survival rate，WSR)，以期为科尔沁沙地苜蓿生产中施钾和水分管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗岩峰农业公司(北纬43°21′，东经119°2′)，属于温带大陆性气候，四季分明，降水集中。年平均气温3℃，10℃以上积温3 000℃，无霜期150 d，年平均降水量400 mm，蒸发量是降水量的4～5倍左右，年平均风速3.7 m·s-1。土壤有机质含量为63.4 mg·kg-1，碱解氮含量34.89 mg·kg-1，全氮含量36.02 mg·kg-1，速效磷含量3.71 mg·kg-1，速效钾含量77.98 mg·kg-1。

1.2 试验方法

供试材料为苜蓿的‘骑士T’和‘公农1号’2个品种，由北京正道有限公司提供，于2017年7月1日进行播种。播种前一次性施入过磷酸钙200 kg·hm-2为基肥。试验设置土壤水分和施钾量2个试验因子，采用两因素裂区随机区组设计，水分处理为主区：灌水时间间隔分别为4 d(W1)，8 d(W2)和12 d(W3)，每次灌溉到距离土壤表面30 cm处，灌水量为15 mm；钾肥施用量水平为副区：50 kg·hm-2K2O(K1)，100 kg·hm-2K2O(K2)和150 kg·hm-2K2O(K3)，并设置不施钾肥为对照(CK)，两个因素共组合成12个处理，每个处理3次重复。共36个小区。三个主区间隔15 m，副区各小区试验面积4 m×5 m=20 m2，各小区间隔为2 m。播种量为22.5 kg·hm-2，供试肥料为氯化钾(K2O≥60%)，灌水方式为指针式喷灌，期间进行正常的田间管理。于11月15日前后(越冬前期)挖取苜蓿越冬器官，带回室内洗净，切取根颈部分测定相关生理指标。

1.3 测定指标及方法

MDA含量采用硫代巴比妥酸法[13]，POD活性采用愈创木酚法[13]，SOD活性采用氮蓝四唑法[13]，CAT活性采用紫外吸收法[13]，SP含量采用考马斯亮蓝比色法测定[13]。

越冬率：于播种当年2017年10月 26 日，每小区随机设1平方米样方3个，统计越冬前苜蓿植株数。2018年3月26日苜蓿出苗至2018年4月1日苜蓿返青全部出苗后(5 d内无新增出苗)，挖出后统计样方内返青植株数，计算越冬率。越冬率=返青植株数/越冬前苜蓿植株数×100%[14]。

1.4 统计分析方法

试验数据用Excel软件处理、制作表格，用DPS7.0软件进行方差显著性分析及相关性分析，采用Duncan检验方法新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 水钾耦合对苜蓿根颈MDA含量的影响

如表1所示，水分和钾肥耦合对苜蓿根颈MDA含量具有显著的影响，在不同灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈MDA含量均随着钾肥施用量的增加而下降，且在K2和K3施用量处理下的苜蓿根颈MDA含量显著小于CK(W2处理除外，P<0.05)，并在K3钾肥施用量处理下达到最小值，其中‘骑士T’品种苜蓿根颈的MDA含量较CK处理降低了45.74%和24.49%，而‘公农1号’品种苜蓿根颈的MDA含量较CK处理降低了32.26%和33.96%，说明施用钾肥有利于降低苜蓿根颈的MDA含量。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈MDA含量均在W2灌水时间间隔处理下达到最小值，在W3灌水时间间隔处理下达到最大值，且W3灌水时间间隔处理下的MDA含量显著高于W2处理(P<0.05)，其中‘骑士T’品种苜蓿的MDA含量较W2处理增长了617.31%，566.67%和564.44%，‘公农1号’品种苜蓿的MDA含量较W2处理增长了332.56%，300.00%和268.42%，说明W2灌水时间间隔处理的水分最有利于减缓苜蓿根颈细胞膜质氧化过程，降低细胞膜受损程度。

表1 水钾耦合对不同品种苜蓿根颈MDA含量的影响

2.2 水钾耦合对苜蓿根颈CAT活性的影响

如表2所示，水分和钾肥耦合对苜蓿根颈的CAT酶活性具有显著的影响，在不同灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈CAT活性均随着钾肥施用量的增加而提高，在K2和K3钾肥施用量处理下的CAT活性均显著高于CK(W3处理的K2钾肥施用量处理除外，P<0.05)，说明施用钾肥有利于提高苜蓿根颈中的CAT活性，其中以施用量为100 kg·hm-2K2O和150 kg·hm-2K2O时，效果更好。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈CAT活性均随着灌水时间间隔的延长而增加(‘公农1号’的K3处理除外)，且在W3灌水时间间隔处理下达到最大值，说明W3灌水时间间隔处理的水分最有利于CAT活性的增强，清除H2O2，保护细胞膜结构。

表2 水钾耦合对不同品种苜蓿根颈CAT活性的影响

2.3 水钾耦合对苜蓿根颈POD活性的影响

如表3所示，在不同灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈POD活性均随着钾肥施用量的增加而提高，其中K2和K3钾肥施用量处理下的POD活性均显著高于CK(P<0.05)，说明施用钾肥有利于提高苜蓿根颈中的POD活性,且以100 kg·hm-2K2O和150 kg·hm-2K2O为宜。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈POD活性均随着灌水时间间隔的延长而增加，在W3灌水时间间隔处理下达到最大值，且与W1灌水时间间隔处理的POD活性差异最显著(P<0.05)，其中‘骑士T’品种苜蓿的POD活性较W1处理提高了55.03%，41.67%和40.14%，‘公农1号’品种的POD活性较W1处理提高了65.89%，73.03%和30.58%，说明W3灌水时间间隔处理的水分最有利于提高POD活性，清除活性氧，降低细胞膜受损程度。

表3 水钾耦合对不同品种苜蓿根颈POD活性的影响

2.4 水钾耦合对苜蓿根颈SOD活性的影响

如表4所示，在不同灌水时间间隔处理下，不同钾肥用量处理的‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈SOD活性均高于CK，且均在K2钾肥施用量处理下达到最大值并显著高于CK(P<0.05)，其中‘骑士T’品种的苜蓿根颈SOD较CK增加了18.51%，18.65%和19.77%，‘公农1号’品种的苜蓿根颈SOD活性较CK增长了36.76%，21.19%，11.64%，说明施用适量的钾肥有利于提高苜蓿根颈中的SOD活性。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈SOD活性在W3灌水时间间隔处理下达到最大值，且与W1灌水时间间隔处理的SOD活性差异最显著(P<0.05)，其中‘骑士T’品种的苜蓿根颈SOD活性较W1处理提高了10.67%，12.70%和9.41%，‘公农1号’品种的苜蓿根颈SOD活性较W1处理增长了13.21%，9.12%和5.33%，说明W3灌水时间间隔处理的水分最有利于提高SOD活性，清除更多活性氧和自由基。

表4 水钾耦合对不同品种苜蓿根颈SOD活性的影响

2.5 水钾耦合对苜蓿根颈SP含量的影响

如表5所示，在不同灌水时间间隔处理下，不同钾肥用量处理的‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈SP含量均高于CK，且在K2钾肥施用量处理下达到最大值，且均显著高于CK(P<0.05)，其中‘骑士T’品种的苜蓿根颈SP含量较CK处理增加了13.42%，11.05%和11.36%，‘公农1号’品种的苜蓿根颈SP含量较CK处理增长了17.49%，14.83%和11.46%，说明施用适量的钾肥有利于提高苜蓿根颈中的SP含量。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿根颈SP含量在W3灌水时间间隔处理下达到最大值(‘公农1号’的K1处理除外)，且与W1灌水时间间隔处理的SP含量差异最显著(P<0.05)，其中‘骑士T’品种的苜蓿根颈SP含量较W1处理提高了17.74%，17.76%和14.59%，‘公农1号’品种的苜蓿根颈SP含量较W1处理提高了32.25%，18.67%和33.61%，说明适当的减少灌水量有利于苜蓿根颈的SP含量的积累，维持细胞内的渗透压。

2.6 水钾耦合对苜蓿WSR的影响

如表6所示，不同灌水时间间隔处理下，不同钾肥用量处理的‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿的WSR均高于CK，且在K2钾肥施用量处理下达到最大值，且均显著高于CK(P<0.05)，其中‘骑士T’品种的苜蓿的WSR比CK增加了52.95%，45.42%和31.39%，‘公农1号’品种的苜蓿的WSR比CK增加了37.23%，47.74%和36.96%，说明适量的钾肥有利于促进苜蓿越冬。在不同钾肥用量处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种的苜蓿WSR在W3灌水时间间隔处理下达到最大值，说明适当的延长灌水时间间隔有利于促进苜蓿越冬。

表6 水钾耦合对不同品种苜蓿WSR的影响

2.7 根颈中MDA与抗氧化酶活性、SP含量及WSR的相关性分析

如表7所示，W1灌水时间间隔处理下，‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈CAT活性与POD活性均呈极显著正相关(P<0.01)；‘公农1号’品种苜蓿根颈MDA含量与SOD活性呈显著负相关(P<0.05)；‘公农1号’品种苜蓿根颈WSR与SOD活性及SP含量均呈显著正相关(P<0.05)；‘骑士T’品种苜蓿MDA含量与POD活性呈显著负相关(P<0.05)；‘骑士T’品种苜蓿SOD酶活性与CAT活性呈显著正相关(P<0.05)，与SP含量及WSR呈极显著正相关(P<0.01)；‘骑士T’品种苜蓿的WSR与CAT，POD活性均呈显著正相关(P<0.05)，说明抗氧化酶活性的增强有利于提高苜蓿WSR，促进抗寒性增强。W2灌水时间间隔处理下，‘骑士T’品种苜蓿MDA含量与SOD，CAT活性呈极显著负相关(P<0.01)；‘骑士T’品种苜蓿CAT活性与SOD活性呈极显著正相关(P<0.01)，与SP含量和WSR呈显著正相关(P<0.05)；‘骑士T’品种苜蓿根颈WSR与SOD活性呈显著正相关(P<0.05)，与SP含量呈极显著正相关(P<0.01)；‘公农1号’品种苜蓿根颈MDA含量与CAT活性呈显著负相关(P<0.05),与POD活性呈极显著负相关(P<0.01)；‘公农1号’品种苜蓿根颈CAT活性与POD活性呈显著正相关(P<0.05)；‘公农1号’品种苜蓿根颈SOD活性与SP含量呈极显著正相关(P<0.01)，与WSR呈显著正相关(P<0.05)。W3灌水时间间隔处理下，‘骑士T’品种苜蓿MDA含量与CAT活性呈显著负相关(P<0.05)；‘骑士T’品种苜蓿根颈SOD活性与POD活性、SP含量均呈显著正相关(P<0.05)；‘骑士T’品种苜蓿根颈SP含量与WSR呈显著正相关(P<0.05)；‘公农1号’品种苜蓿根颈MDA含量与CAT、POD活性呈极显著负相关(P<0.01)；‘公农1号’品种苜蓿根颈CAT活性与POD活性呈显著正相关(P<0.05)；‘公农1号’品种苜蓿根颈SOD活性与WSR呈极显著正相关(P<0.01)。以上说明苜蓿根颈中抗氧化酶、SP含量越高，MDA含量就越低，植物受伤害程度越轻，苜蓿越冬能力更强。

表7 苜蓿根颈MDA与抗氧化酶活性、SP含量及WSR的相关性分析

3 讨论

当土壤中水分和肥力状况不利于植物生长时，会对植物产生胁迫作用，使植物体内氧代谢失去动态平衡，活性氧大量积累，进而导致膜脂过氧化，积累很多过氧化产物如MDA等，因此，MDA含量可用作反应植物受伤害程度的指标[16]。本研究表明，‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈的MDA含量在灌水时间间隔为W1的处理时较高，在W2灌水时间间隔处理达到最小值，在W3灌水时间间隔处理时达到最大值，说明灌水时间间隔为8 d时最有利于减轻细胞氧化过程的伤害；张淋淋[17]的研究表明，土壤水分含量过少和过多均会对质膜造成损伤，并且胁迫强度越大损伤程度越严重，与本研究结果一致；刘岱松[18]的研究表明二倍钾浓度处理、以及添加氨基酸和钾处理降低烟苗(NicotianatabacumL.)叶片MDA含量，而本研究结果表明随着钾肥施用量的增加，苜蓿根颈中MDA含量表现为下降的变化趋势，并在K3钾肥施用量下达到最小值，说明钾肥施用量水平为150 kg·hm-2K2O最有利于降低活性氧在植物体内积累。

SP是植物体内非常重要的渗透调节物质，具有降低渗透势增加细胞质浓度，保持膨压，缓解脱水胁迫伤害的生理作用，以保持细胞正常的生理过程[26]。本研究结果表明，‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈SP含量随着灌水时间间隔的延长而增多，在W3处理灌水时间间隔处理达到最大值；随着钾肥施用量的增加，‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈SP含量表现为先升高后降低的变化趋势，并在100 kg·hm-2K2O施用量处理达到最大值；苏志豪[27]的研究表明随着土壤干旱程度的加剧，沙生柽柳(Tamarixtaklamakanensis)种群叶片内SP呈上升趋势；董庆[28]的研究结果表明随着钾肥水平的升高，蕨麻(PotentillaanserinaL.)叶片中SP含量成先升后降的趋势，在78 kg·hm-2K2O到达最大值，与本研究结果一致。可能是由于钾元素参与者植物体内蛋白质的代谢过程，适量的钾肥促进了游离氨基酸等物质转化为SP，并且钾还能活化与蛋白质合成有关的酶，即有利于提高苜蓿根颈中SP含量[29-30]，SP含量增多，有利于调节渗透势，维持细胞渗透压和膨压，保护生物膜的稳定性，维持细胞正常代谢。本研究结果表明，苜蓿WSR在W3处理灌水时间间隔处理下达到最大值，且随着钾肥施用量的增加表现为先升高后降低的趋势，且在K2施用量处理下达到最大值；说明适量的钾肥及水分胁迫有利于促进苜蓿越冬；孙洪仁[31]的研究结果表明钾作为抗逆元素，苜蓿根部富含钾素可有效提高作物抗寒性，利于苜蓿安全越冬，与本研究结果一致。并且本研究结果表明，苜蓿WSR与抗氧化酶活性呈显著正相关，可能的原因是，抗氧化酶活性的增强能通过清除细胞内的活性氧和自由基，减少细胞内有毒害作用的物质对细胞膜的损伤，保护细胞膜结构，进而增强苜蓿的抗寒能力，促进苜蓿安全越冬[1]，其机理还有待进一步研究。

4 结论

综上所述，‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈丙二醛含量K2和K3钾肥施用量处理下显著小于CK(W2处理除外，P<0.05)；骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈过氧化氢酶、过氧化物酶活性在W3灌水时间间隔处理下最强，且在K2和K3钾肥施用量处理下与CK差异最显著(P<0.05)；‘骑士T’和‘公农1号’品种苜蓿根颈在W3灌水时间间隔处理和K2钾肥施用量处理下超氧化物歧化酶活性最强，可溶性蛋白含量和越冬率均最高。因此建议在科尔沁沙地进行苜蓿栽培，灌水时间间隔为12 d，钾肥施用量为100 kg·hm-2K2O。