景天三七根、茎、花、叶中总黄酮含量测定

王立业，牛江秀，王真真，吴玉琦，马紫玉，王艳艳，于志斌

（1.洛阳师范学院食品与药品学院，河南 洛阳 471934；2.中国医药保健品进出口商会，北京 100010）

景天三七（Sedum aizoonL.）为景天科景天属多年生草本植物，又名菊叶三七、养心草、八仙草、活血丹、血山草、长生景天、金不换等，素有高原人参和雪山仙草之称，是中国传统的药食两用植物，全年可采集，全草或根均可入药或食用。由于其易于栽培种植，生命力顽强，近年来被大量种植，广泛分布于中国东北、西北、华北及长江流域各省市［1］。景天三七性平，味甘、微酸，归心、肝经，具有凉血止血、消炎、散瘀止痛、解毒消肿、滋阴养血、安神的功效，常用于治疗跌打损伤、创伤出血、吐血、产后血气痛等。现代药理研究表明，景天三七具有抗衰老、抗缺氧、抗疲劳、抗炎及改善心脑血管系统及免疫调节作用［2］。

近年来对景天三七的研究越来越受到重视，研究表明，景天三七所含有效成分有多糖类、黄酮类、酚酸类、生物碱类、β-谷甾醇等［3］。其中，黄酮类是景天三七的主要功效成分之一。黄酮类是具有C6-C3-C6基本骨架（图1）化合物的总称，是广泛存在于植物界的一大类天然产物，如杨梅黄酮、山楂黄酮、大豆异黄酮等，种类繁多，常作为药材质量控制指标［4］。黄酮类化合物具有明确而广泛的药理作用，具有抗氧化、抗胃溃疡、神经保护、抗心肌缺血、降血压、改善学习记忆认知、保护生殖系统、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及降血糖等多种药理活性［5，6］。因此，对景天三七黄酮的开发具有重要的应用价值。目前对景天三七的研究多集中于提取工艺、部分功效成分的含量测定和药理活性研究［2］，尚未建立对景天三七不同部位中总黄酮含量的测定方法，制约着景天三七黄酮的开发和利用。

图1 黄酮类化合物的基本骨架结构

关于黄酮类物质检测的现行标准方法主要分3类：高效液相法、液相色谱-串联质谱法和分光光度法［7］。高效液相法和液相色谱-串联质谱法通常需要贵重的仪器设备、操作复杂，并需要多种对照物，不能对样品中所含有的总黄酮物质进行准确定量，缺乏适用性且应用范围有限。分光光度法结果准确，经济、简单快速，并能对总黄酮含量进行准确分析，被广泛应用于多种植物中总黄酮的含量测定。本研究拟采用索氏提取法对河南产景天三七根、茎、花、叶中的总黄酮进行提取，以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作显色剂，建立景天三七根、茎、花、叶中总黄酮含量测定的分光光度方法，并对该方法的最大吸收波长、检测限、定量限、线性、准确度、精密度进行考核，为景天三七总黄酮的含量测定提供方法学依据，同时为了解景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的分布及有针对性的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

新鲜景天三七样品采自河南省洛阳市、三门峡市等地区，采集时间为2019 年7—9 月，经鉴定为景天三七。将其不同部位进行分类，干燥后粉碎，过80 目筛备用。

1.2 仪器

T6 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TU-1810 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004 电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 试剂与溶液

芦丁对照品，中国食品药品检定研究院提供（100080-201907，含量测定用）。10 g/L 氢氧化钠溶液：称取10.0 g 氢氧化钠，用水溶解后定容至1 L。50 g/L 亚硝酸钠溶液：称取5.0 g 亚硝酸钠，用水溶解后定容至100 mL。100 g/L 硝酸铝溶液：称取10.0 g硝酸铝，用水溶解后定容至100 mL。甲醇等其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.4 对照品及供试品溶液的制备

1）对照品溶液的制备。精密称取在60 ℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使其完全溶解，冷却至室温，加甲醇定容至刻度，摇匀。从中精密量取10 mL，转移至100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液（芦丁含量为0.2 mg/mL）。

2）供试品溶液的制备。分别精密称取景天三七根、茎、花、叶样品1.0 g 于滤纸包中，置索氏提取器抽提瓶内，加甲醇90 mL，加热回流至提取液无色，将提取液转移至100 mL 容量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液一同并入同一容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。从中精密量取3 mL 用于测定。

1.5 测定

精密量取一定量的对照品溶液和供试品溶液，置于25 mL 容量瓶中，加水至10.0 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，混匀后放置6 min，最后加入氢氧化钠溶液4 mL，加水定容至刻度，摇匀后放置15 min。以相应的试剂为空白，用紫外分光光度法测定。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

精密量取供试品溶液3 mL 置于25 mL 容量瓶中，制备样品溶液，以相应试剂为空白，于紫外分光光度计上，在190～800 nm 内进行扫描，结果见图2。由图2 可以看出，样品显色液在365 nm 处有最大吸收，因此选择365 nm 作为景天三七总黄酮测定的最佳吸收波长。

图2 样品显色液在190～800 nm的紫外扫描

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL 容量瓶中，制备样品溶液，以相应试剂为空白，在365 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线（图3），最小二乘法直线回归，得芦丁回归方程为：y=0.017 5x+0.04，R2=0.999 9（n=5）。结果表明，芦丁浓度在8～40 μg/mL 线性关系良好。

图3 芦丁标准曲线

2.2.2 检测限与定量限 取干净的25 mL 容量瓶20个，分别准确加入10 mL 去离子水，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，混匀后放置6 min，最后加入氢氧化钠溶液10 mL，加水定容至刻度，摇匀后放置15 min。以去离子水为空白，按紫外分光光度法在365 nm 处测定吸光度。检测限和定量限分别按如下公式进行计算。

式中，σ 为空白响应的标准差；S为标准曲线斜率。

结果表明，20次空白测定的标准偏差为0.006 0，标准曲线的斜率为0.017 5，由此可计算得到方法的检测限为1.13 μg/mL，定量限为3.43 μg/mL。

2.2.3 精密度试验 分别准确称取景天三七根、茎、花、叶粉末样品1.0 g，制备样品溶液。精密量取3.0 mL 测定吸光度，重复测定6 次，结果见表1。由表1可知，根、茎、花、叶中总黄酮含量的平均值分别为2.94%、2.80%、0.98%和1.62%，RSD分别为0.14%、0.09%、0.04%和0.05%，变异系数均≤2%，表明该方法的精密度良好。

表1 景天三七根茎花叶中总黄酮含量测定精密度考察结果

2.2.4 准确度试验 方法的准确度以样品添加回收试验进行评价。精密吸取芦丁对照品溶液（浓度为0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0 mL 各3 份，置于25 mL 容量瓶中，分别加入已知含量的景天三七根、茎、花、叶供试品溶液样品溶液3.0 mL，测定吸光度。回收率计算公式如下。

式中，P为芦丁添加回收率，%；A为样品添加后的吸光度；A0为样品添加前的吸光度；m为芦丁的加入量，mg。

景天三七根、茎、花、叶中不同添加水平的回收率结果见表2。由表2 可知，景天三七根、茎、花、叶中低、中、高3 个添加浓度芦丁的平均回收率分别为93.87%、92.85%、94.58%和93.00%，RSD分别为4.31%、3.42%、2.39%和2.69%，RSD均≤5%，表明该方法的准确度良好，满足定量方法学的要求。

表2 景天三七根、茎、花、叶总黄酮含量测定准确度考察结果

2.2.5 稳定性试验 将制备的根、茎、花、叶供试品显色后，分别在0、30、60、90、120、180 min 测定其吸光度，考察供试品显色后的稳定性，结果见图4。由图4 可知，随着放置时间的延长，样品的吸光度逐渐增大，在显色后第90 min，吸光度变化值小于5%，表明所有样品显色后在90 min 内稳定，测定应在显色后90 min 内完成。

图4 景天三七根、茎、花、叶样品显色后稳定性试验结果

2.3 景天三七根、茎、花、叶中总黄酮含量测定结果

按照所建立的方法，对景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的含量进行测定，根据芦丁标准曲线的回归方程，计算得出河南产景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的含量见表3。由表3 可知，所采集河南产景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的平均含量分别为（29.44±1.37）、（27.96±0.87）、（9.79±0.36）、（16.16±0.50）mg/g（以芦丁量/干材料表示，n=6）。

表3 景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的测定结果（n=6）

3 讨论

黄酮类化合物因具有多种生物活性、药理作用和复杂的药效作用机制，一直是药物研发领域关注的重点。根据C6-C3-C6基本骨架上中央三碳的氧化程度、是否成环、B 环的联接位点等特点，可将该类化合物分为多种结构类型，如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮；异黄烷酮、查耳酮、二氢查耳酮、橙酮、黄烷和黄烷醇、花色素类、双黄酮类［8］。尽管黄酮类单体多种多样，但黄酮类化合物中常带有可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐、锶盐、铁盐等试剂发生反应的结构单元，生成有色络合物。因此金属盐类试剂络合显色-分光光度法被作为测定总黄酮含量的常用方法［7］。因显色剂NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 显色稳定、价格低廉、环境污染小等因素，被广泛应用于中草药中总黄酮的含量测定，检测波长为510 nm［9］。考虑到不同植物中黄酮的种类差异，本研究对景天三七黄酮经NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色后的最大吸收波长进行了测定，在波长190～800 nm的紫外分光光度扫描结果表明，景天三七黄酮与铝盐在365 nm 有最大吸收，而在510 nm 附近的吸收峰不明显，为使分析具有更好的灵敏度和特异性，因此选择365 nm 作为测定波长，在该波长下，对照品芦丁浓度在8～40 μg/mL，标准曲线的线性相关系数R2=0.999 9，表明在选择的测定波长下，标准曲线的线性关系良好，满足定量方法学的要求。

黄酮类化合物是一类广泛存在于蔬菜、水果和中草药中的化合物，是植物的次级代谢产物。由于结构中多含有苷元，一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂和稀碱液。根据文献报道［10］，黄酮的提取方法有溶液提取法、超声提取法、复合酶辅助高压提取法、减压内部沸腾法和超声辅助双水相萃取法等。溶液提取法中，甲醇和乙醇普遍应用于苷和苷元，热水提取法普遍应用于黄酮苷。考虑到甲醇和乙醇性质的相似性，本研究比较了甲醇和热水作为溶剂对景天三七总黄酮的提取效率，结果显示，甲醇作提取剂时黄酮的测得量显著高于热水，表明景天三七所含黄酮以含苷或苷元为主的黄酮类物质。由于索氏提取法具有操作简单、试剂可以反复循环、提取效率高，同时能避免其他方法多次提取造成的操作误差等优势，本研究建立以甲醇为溶剂，索氏提取法对景天三七黄酮测定的样品前处理方法，方法学考察显示，根、茎、花、叶中低、中、高3 个水平芦丁的平均回收率均≥92%，变异系数≤5%，表明所建立的样品前处理方法对景天三七黄酮具有较好的提取效率和稳定性。

按照所建立的方法，对河南产景天三七根、茎、花、叶中总黄酮的测定结果表明，景天三七根、茎、花、叶普遍存在黄酮类化合物，但各个部位样品中总黄酮含量存在差异。总黄酮含量最高的为根，含量可达29.44 mg/g，其次是茎，其总黄酮含量为27.96 mg/g，叶中总黄酮含量为16.16 mg/g；花中总黄酮含量最少，仅为9.79 mg/g。这与紫萁（根状茎＞叶）［11］、青钱柳（根＞茎＞叶）［12］、藜蒿（根＞茎＞嫩芽）［13］等植株中的总黄酮分布趋于一致，但与沙棘（根＜茎＜叶）［14］、荞麦（茎＜根＜果＜叶＜花）［15］等植株中的总黄酮分布呈相反趋势，表明黄酮类化合物在不同植物器官中的分布与植物器官所承担的功能有关，同时也呈现一定的种属差异。因此，对不同植株中黄酮类物质的开发利用应具体问题具体分析。就景天三七而言，茎叶部分通常作蔬菜等食用，根食用的普遍性受到限制，但根部黄酮含量最高，如果能将其作为原料进行化工或功能食品开发，将进一步提高景天三七应用的市场价值。对比其他地区景天三七黄酮的含量，本研究所测定的河南产景天三七黄酮含量 低于 陕西 产（39.57±0.59）mg/g［16］，高 于河 北产（18.39.57±0.40）mg/g，与黔产28.32 mg/g 相当［17］，除了可能的采收时期影响外，表明不同产地的景天三七中黄酮含量存在一定的差异。