仙灵骨葆胶囊对骨质疏松性骨折大鼠骨生长因子及骨折愈合的影响

黄振峰 王建 陈梦妮 肖军

1. 武汉市第四人民医院古田院区创伤骨科，湖北 武汉 430000 2. 淄博市临淄区齐都医院关节与运动医学科，山东 淄博 255400 3. 武汉市同济医院手术室，湖北 武汉 430000

随着中国乃至全世界人口结构日趋老龄化，骨质疏松症(osteoporosis，OP)已成为中老年常见病和多发疾病，且发病率呈现逐年上升的趋势，骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作为OP最严重的并发症，OPF因骨质疏松个体骨质量下降，骨骼组织学基础变差，骨折愈合过程缓慢，导致骨折愈合延迟和不愈合概率显著增加，同时骨折后患者活动减少，合并严重并发症概率显著增多，严重威胁着中老年人群的身心健康，同时也带来了沉重的社会负担[1-2]。因此，探索行之有效加速OPF的药物研究有着非同寻常的意义。中药治疗骨质疏松及骨折历史悠久，疗效确切，研究表明仙灵骨葆可促进骨质疏松性大鼠骨折早期骨痂形成，促进去卵巢大鼠骨折愈合，已用于临床OPF的预防和治疗[3]。本研究以去势后骨质疏松性骨折大鼠为模型，探讨仙灵骨葆胶囊对骨折愈合过程骨生长因子BMP-2、IGF-1表达的影响及骨折愈合作用，以期为临床提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

48只健康雌性4月龄Sprague-Dawley大鼠，平均体重(330±22)g，所有大鼠均由华中科技大学动物实验中心提供[许可证号：SCXK(鄂)2016-0009]，饲养于华中科技大学实验动物中心。复方戊酸雌二醇片(国药准字：H20020299，生产批号：150716，浙江仙琚制药股份有限公司)，仙灵骨葆胶囊[国药准字：Z20025337，生产批号：141226，国药集团同济堂(贵州)制药有限公司]。血清Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)试剂盒购于南京建成生物工程公司，兔抗鼠骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和胰岛素生长因子-1(IGF-1)多克隆抗体均购于武汉博士德生物有限公司。计算机X射线摄像仪购于日本Konica Minolta公司，XR-36型双能X线骨密度仪(DXA)购于美国Norland公司，AGS-X型万能精密材料试验机购于日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1模型制备及分组：模型构建参照文献[4]构建“骨质疏松性骨折SD大鼠模型”，首先行双侧卵巢切除术，腹背中线L2纵行切口，分离进入腹腔，严密结扎输卵管，切除卵巢组织，术后1周再行右侧股骨干骨折髓内固定术，右大腿外侧纵行切口，分离暴露并锯断股骨中段，克氏针插入骨折远端，达到解剖复位，逐层间断缝合，术后常规预防感染。术后排除造模失败及因手术感染先后死亡大鼠。按随机数字法分为假手术组、模型组、雌二醇组和仙灵骨葆组，模型组、雌二醇组和仙灵骨葆组均构建去卵巢大鼠骨质疏松性骨折模型，假手术组开腹后仅切除卵巢周围部分脂肪组织，未切除双侧卵巢。于术后1周给予不同药物干预。假手术组和模型组：0.9 % NaCl 5 mL/kg，灌胃，1次/d；雌二醇组：复方戊酸雌二醇片，0.5 mg/kg，灌胃，1次/d；仙灵骨葆组：仙灵骨葆胶囊，250 mg/kg，灌胃，1次/d，给药8周。

1.2.2标本收集与处理：实验结束后先行计算机X射线摄像仪摄片，10 %水合氯醛麻醉，采取脱颈法处死各组大鼠，下腔静脉采血，离心分离血清-20 ℃保存备用，逐层剥离完整取出股骨及股骨骨痂，截取骨折端股骨痂，中性甲醛固定，EDTA硝酸脱钙，脱水透明，石蜡包埋，制备石蜡切片。

1.2.3放射性(X线)检查：将完整的右股骨骨折标本行计算机X射线摄像仪摄片，CR摄片条件：距离90 cm，电流3.2 mA，电压40 kV，观察骨折骨痂连续性及骨折愈合情况，应用Warden[5]X线评分系统进行评估，取均值。

1.2.4股骨痂骨密度(BMD)检测：将完整的右股骨骨痂采用双能X线骨密度扫描仪扫测，运用小物体扫描模式：扫描宽度5.0 cm，扫描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，准确度0.01 %，分别测量各组骨痂BMD(g/cm2)，取均值。

1.2.5股骨骨生物力学检测：骨生物力学检测参考文献[6]分别对每个股骨试样预调处理之后进行三点弯曲实验和压缩实验，依据仪器记录的载荷-位移曲线计算出最大荷载、最大应力和最大位移等数据。

1.2.6骨代谢相关指标检测：采用比色法参照试剂盒说明书分别检测各组血清骨钙素(BGP)、I型前胶原羧基前肽(PICP)浓度。

1.2.7免疫组织化学染色法检测：免疫组织化学染色法参考文献[7]，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对阳性反应细胞平均光密度值(MOD)进行半定量分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 骨折愈合及评分骨折愈合观察及评分

假手术组大量连续性骨痂生长包饶骨折端，断端髓腔再通，骨折线消失。模型组骨折端未见骨痂生长，骨折线依然清晰可见。雌二醇组少量不连接性骨痂生长包饶骨折端，骨折线部分模糊不清。仙灵骨葆组大量连续性骨痂包绕贯穿骨折端，髓腔再通，骨折线模糊不清。X射线摄片结果显示：模型组(2.542±0.153)较假手术组(4.773±0.226)评分显著降低(P<0.05)，雌二醇组(3.970±0.202)和仙灵骨葆组(4.520±0.235)较模型组(2.542±0.153)评分均显著升高(P<0.05)，以仙灵骨葆组最高。见图1。

图1 X线观察骨折愈合情况注：A： 假手术组；B： 模型组；C： 雌二醇组；D： 仙灵骨葆组。Fig.1 X-ray observation of fracture healing

2.2 各组大鼠骨痂BMD

模型组较假手术组股骨上下端骨痂BMD显著降低(P<0.05)，雌二醇组、仙灵骨葆组均较模型组股骨上下端骨痂BMD均显著增高(P<0.05)，以仙灵骨葆组最高。见表1。

表1 各组大鼠股骨Table 1 BMD of rat femur in each

2.3 各组大鼠骨痂生物力学

模型组较假手术组骨痂最大位移、最大应力和最大载荷均显著降低(P<0.05)，雌二醇组、仙灵骨葆组均较模型组骨痂最大载荷、最大应力和最大位移均显著升高，以仙灵骨葆组最高。见表2。

表2 各组大鼠股骨生物力学指标

2.4 各组大鼠血清骨代谢相关指标

模型组较假手术组血清BGP、PICP、TRACP-5b水平均显著升高(P<0.05)，雌二醇组、仙灵骨葆组均较模型组血清BGP、PICP、TRACP-5b水平均显著降低，以仙灵骨葆组最低。见表3。

表3 各组大鼠血清骨代谢指标

2.5 各组大鼠骨痂BMP-2、IGF-I表达

BMP-2主要表达于成骨细胞胞浆及骨小梁的边缘，IGF-I主要表达于成骨细胞及软骨细胞胞浆，棕黄色为阳性反应。模型组较假手术组BMP-2和IGF-I阳性表达均显著降低(P<0.05)，雌二醇组、仙灵骨葆组较模型组BMP-2和IGF-I阳性表达均显著增高(P<0.05)，以仙灵骨葆组最高。见表4、图2和图3。

图2 免疫组化观察骨痂组织BMP-2表达(200×)注：A：假手术组；B：模型组；C：雌二醇组；D：仙灵骨葆组。Fig.2 The BMP-2 expression in callus was observed by Immunohistochemistry (200×)

图3 免疫组化观察骨痂组织IGF-I表达(200×)注：A：假手术组；B：模型组；C：雌二醇组；D：仙灵骨葆组。Fig.3 The IGF-I expression in callus was observed by Immunohistochemistry(200×)

表4 各组骨痂组织BMP-2、IGF-1表达

3 讨论

中医学将OP归属“骨痿”“骨枯”“骨痪”“骨痹”等范畴，传统中医理论认为OP发病与肾关系密切[7]。中医理论认为肾主身之骨髓，肾藏精，精生髓，髓生骨，骨枯髓减，发为骨痿，精足则髓足，髓足者则骨强，肾精充足，骨髓有源，骨骼强健有力，肾精亏虚，骨髓无源，骨骼痿弱无力，骨脆致病[8-9]。骨的生长、发育、强壮、衰弱是肾中精气盛衰的重要标志，中药防治OP紧紧围绕中医肾主骨生髓理论。

仙灵骨葆胶囊是由国家食品药品监督管理总局(CFDA)认证的非处方(OTC)传统纯中药制剂，原方主要由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参、地黄等多味中药组成，被用于防治骨质疏松、骨折、无菌性骨坏死[10-11]。仙灵骨葆胶囊以贵州特产黔岭藿为主药，配以续断、补骨脂、知母、丹参等具有补肾壮骨作用的中药合剂[12]。淫羊藿为主药，补肾壮阳坚筋骨、祛风除湿、强筋健骨之要药，配以续断，补骨脂，知母，丹参，地黄等为佐使药，全方共奏滋补肝肾、活血通络和强筋壮骨之功效[13]。研究表明仙灵骨葆胶囊通过雌激素样作用，增强成骨细胞活性、改善微环境和调节钙磷微量元素代谢、增加矿物质沉积并抑制骨吸收，提高骨量、增加骨密度和骨强度，增加骨折局部血流量，加速骨性骨痂形成，促进骨质修复和加快骨重建[14-15]。

骨折愈合过程受局部骨生长因子的调控，骨细胞生长因子对于成骨的诱导、骨基质的合成、软骨骨化及局部微循环的重建等过程发挥重要作用，调控着骨折再生修复过程[16-17]。BMP-2和IGF-I在骨质疏松性骨折的愈合不同阶段均起到重要的调节作用，BMP-2和IGF-I能够刺激和诱导成骨细胞分化增殖，增强成骨细胞活性而增加骨量，加速骨重建以促进骨折愈合[18-19]。本研究结果表明仙灵骨葆组较模型组骨折愈合评分、股骨痂BMD、股骨骨生物力学指标、骨痂BMP-2和IGF-I阳性表达均显著升高(P<0.05)，仙灵骨葆组较模型组血清骨代谢指标均显著降低(P<0.05)。说明仙灵骨葆胶囊通过介导骨质疏松骨折大鼠骨生长因子BMP-2和IGF-1表达，改善骨代谢，促进骨痂形成，增加骨密度，提高骨生物力学，促进骨折愈合。提示仙灵骨葆胶囊可促进骨质疏松性骨折愈合过程，可能与骨折周围骨生长因子BMP-2和IGF-I的表达相关。田发明等[20]发现仙灵骨葆胶囊可提高骨质疏松骨折大鼠骨痂组织的血管数量，上调BMP-2表达，促进骨折愈合血管形成。穆树林等[21]研究发现仙灵骨葆胶囊可能通过上调骨质疏松骨折大鼠BMP-2表达，加快编织骨向板层骨的转化，促进骨折愈合。吴继云等[22]研究发现仙灵骨葆胶囊可促进老龄去势大鼠骨质疏松性骨折愈合过程，可能机制与提高骨折周围软组织PDGF、TGF-β和VEGF表达相关。

综上所述，仙灵骨葆可改善骨质疏松性骨折大鼠骨代谢，促进骨痂形成，增加骨密度，提高骨生物力学性能，促进骨折愈合，其作用机制可能与仙灵骨葆胶囊通过介导骨生长因子BMP-2和IGF-1表达有关。虽然仙灵骨葆胶囊对OPF临床及实验研究均取得较大的进展，为防治OPF提供了新的思路，但中药及其复方制剂成分及作用机制复杂，应结合现代科学实验方法，将传统医学辩证论治、整体调理的优势和现代西医学理论充分结合起来，为临床治疗及新药研发提供依据，推动祖国传统医学的可持续发展。