组蛋白去乙酰化酶1在慢性鼻窦炎上皮细胞中的表达及其对鼻黏膜上皮间质转化的影响

蒋 迪，王仙仁，林正权，黄妙铭，毛志强，徐志鸿，何锦添，傅 明南方医科大学附属东莞市人民医院 耳鼻咽喉科，广东东莞 53000；中山大学附属第一医院 耳鼻喉科，广东广州 50000

慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是一种常见的鼻腔鼻窦黏膜炎症，多中心流行病学调查显示我国CRS的总患病率为8.0%(4.8% ～9.7%)[1]。CRS的病理学特点表现为鼻腔及鼻窦黏膜的慢性炎症，根据炎症程度的不同包括从黏膜增厚到息肉形成的不同阶段[2]。其主要病理学变化为反复的黏膜上皮损伤、基底膜增厚、腺体增生、细胞外基质改变及炎症细胞浸润。临床上常分为慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)和慢性鼻窦炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition state，EMT)是上皮组织重塑的关键环节之一，在CRS的发病中有重要作用，但其具体机制尚未阐明[3-4]。Sirtuin是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，具有广泛的作用底物，可以调节能量代谢平衡、细胞氧化应激、细胞增殖、基因组稳定性和衰老等多种病理生理过程，其家族成员(Sirtuin 1~7)在多种疾病的EMT过程中也扮演着重要角色[5-9]。Sirtuin 1(SIRT1)作为最早在人体内被发现的Sirtuin蛋白家族中的一员，近年来在下呼吸气道炎症性疾病、肺纤维化等呼吸系统疾病的研究中备受关注[10-11]。然而，Sirtuin 1对鼻黏膜上皮EMT的调控作用则报道较少。本研究利用免疫组织化学染色、Realtime PCR、Western blot检测CRSsNP上皮细胞中SIRT1的表达，并应用细胞学实验探讨其对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导鼻黏膜EMT的影响。

材料与方法

1 标本收集 2019年9月- 2020年5月在东莞市人民医院耳鼻咽喉头颈外科进行鼻内镜手术的CRSsNP患者共20例。诊断基于患者的临床病史、前鼻镜检查、鼻内窥镜检查及鼻旁窦CT检查，符合欧洲鼻-鼻窦炎和鼻息肉临床指南(EPOS 2020)诊断标准[12]。其中男12例，女8例，年龄13 ～70岁，平均45.9岁；另收集同期在东莞市人民医院因除慢性鼻窦炎之外的疾病而行鼻内镜手术患者的中鼻道筛窦黏膜组织标本15例作为对照组，CT提示对照组所有个体均无鼻窦炎性疾病。其中男8例，女7例，年龄19 ～45岁，平均34.7岁。CRSsNP黏膜上皮取自病变筛窦黏膜组织，样本收集后立即以4%多聚甲醛固定，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋。对照组及CRSsNP患者排除标准：术前1个月内接受抗生素、糖皮质激素及抗组胺药物治疗；单侧后鼻孔息肉、真菌性鼻-鼻窦炎、变应性鼻炎、哮喘、囊性纤维化、糖尿病、艾滋病、免疫系统性疾病等免疫系统功能不全；该研究在东莞市人民医院伦理委员会的同意和监督下开展(伦理注册号：KYKT2018-039)，并与患者及家属签署知情同意书 ，获得患者及家属的知情同意。

2 主要试剂与设备 SIRT1、E-cadherin、Ncadherin、α-SMA、Vimentin、TGF-β1和GAPDH引物购于上海生工生物有限公司；SIRT1 (ab189494)、E-cadherin (ab1416)、α-SMA (ab5694)、Vimentin(ab8978)、N-cadherin (ab18203)、GAPDH (ab9485)抗体购于英国Abcam公司；Trizol购于美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购于瑞士ROCHE公司；SYBR green染料购于美国Thermo公司；总蛋白提取试剂RIPA购于美国Invitrogen公司。石蜡切片机和烤片机(德国LEICA公司)；抗原修复锅(北京海德创业科技有限公司)；正置显微镜(日本Olympus公司)；-80℃超低温冰箱(美国Thermo公司)；实时定量PCR仪(美国ABI7500)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司)；Western blot电泳仪、电转槽(美国Bio-Rad公司)；恒温水浴箱(上海博迅医疗 生物仪器有限公司)。

3 RNA提取及RT-PCR Trizol裂解液提取总RNA，反转录cDNA合成试剂盒制备cDNA。通过ABI7500实时荧光定量PCR仪检测各组样本，以GAPDH为内参基因，每个样品重复检测3次，用ΔΔCT法计算相对表达量。实验重复3次。以生物信息学软件GenBank检索相关基因序列，采用 Primer 5软件设计引物，具体序列见表1。

表1 目的基因引物序列Tab. 1 Primers used for reverse transcription-quantitative PCR

4 免疫组织化学染色 组织标本在4%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，蜡块切片(4 µm)后步骤如下：切片脱蜡，抗原修复，清除过氧化物，一抗(E-cadherin及N-cadherin、α-SMA、Vimentin)孵育过夜后，辣根过氧化物酶标记的二抗IgG孵育(中杉金桥PV9000)，DAB显影，Mayer苏木素复染，脱水，中性树胶封片后显微镜下观察，免疫组织化学检测细胞膜染成棕黄色为阳性表达。200倍视野下随机选取5处视野进行观测。结果判定：以胞质棕色颗粒状染色为阳性细胞，在光镜下(200×)选取5个视野，对阳性细胞的染色强度进行半定量评价，分为4个等级。1级：阴性，细胞无表达，0分；2级：细胞表达阳性弱，1分；3级：细胞表达阳性中等，2分；4级：细胞表达阳 性强，3分。

5 Western blot检测 提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。95℃变性5 min，取20 µg蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭后分别加入E-cadherin及N-cadherin、α-SMA、Vimentin、GAPDH一抗(除GAPDH稀释比例为1∶100 000，其他一抗稀释比例均为1∶1 000)，4℃孵育过夜后加入二抗Anti-mouse/rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Cell Signaling，1∶2 000)，ECL化学发光法(美国Thermo公司)敷膜，Bio-Rad化学发光成像仪显影，采集图像，实 验重复3次。

6 人鼻黏膜上皮细胞原代培养、转染和EMT诱导 取单纯鼻中隔偏曲患者偏曲对侧鼻腔的下鼻甲鼻黏膜组织，用无钙镁离心磷酸盐缓冲液清洗3次，后置于DMEM/F12培养液，加入0.1%胶原蛋白酶ⅩⅣ中4℃消化12 ～24 h。用10% FCS终止消化。细胞经清洗、离心后，置于塑料培养瓶中，37℃静置1 h，去除成纤维细胞。收集悬浮细胞，以105/孔的细胞密度置于膜孔径0.4 µm、生长面积0.33 cm2的Transwell中，在37℃、21%O2、5% CO2条件下进行培养，培养液采用BEGM，隔天换液。待细胞融合，去除Transwell上室培养液，采用气液界法继续培养。为诱导鼻黏膜上皮细胞EMT，向培养基中加入50 ng/mL TGF-β1(由上海生工合成)，诱导24 h、48 h和72 h后观察鼻黏膜上皮细胞形态。细胞的转染采用Lipofectamin 2000，按说明书分别将1 µg SIRT1和pcDNA(3.1+)质粒转染至鼻黏膜上皮细胞中，转染48 h后更新培 养基。

7 统计学分析 采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示。Kruskal-Wallis检验分析数据正态分布。两组间比较采用Student t检验。三组比较采用One-way ANOVA，Bonferroni post hoc test分析组间差异。P＜0.05为差异有统计学 意义。

结 果

1 SIRT1在CRSsNP黏膜上皮细胞中表达减少 从细胞形态判断，SIRT1主要表达于正常鼻黏膜上皮细胞胞质中，呈棕色颗粒状染色(图1A)。黏膜下层中浆液腺腺体阳性强度增强，部分黏液腺腺体阳性(图1B)。而CRSsNP鼻黏膜上皮的SIRT1表达明显较正常鼻黏膜上皮减少。CRSsNP上皮层表达SIRT1阳性评分(1.25±0.55)明显低于正常对照组(2.6±0.51，P＜0.001)。但CRSsNP组与正常对照组在局部腺体表达SIRT1的阳性评分差异无统 计 学 意 义(2.05±0.39 vs 2.27±0.46，P＞0.05)。Western blot结果显示CRSsNP组SIRT1蛋白水平明 显低于正常鼻黏膜组织(P＜0.001)。见图2。

图1 高倍镜(200×)下免疫组化检测SIRT1在CRSsNP和对照组筛窦黏膜中的表达。正常鼻黏膜上皮和固有层腺体SIRT1表达均为强阳性；CRSsNP黏膜上皮SIRT1表达为弱阳性，固有层腺体SIRT1表达为强阳性Fig.1 Control ethmoid sinus mucosa from patients without nasal disease, ethmoid sinus mucosa from patients with CRSsNP were immunostained with SIRT1 antibodies. SIRT1 was strongly positive in mucosa epithelia and glands in lamina propria from control subject. SIRT1 was weakly positive in mucosa epithelia, while strongly positive in glands in lamina propria from patients with CRSsNP

图2 Western blot检测正常鼻黏膜组织和CRSsNP中SIRT1蛋白相对表达量Fig.2 Protein expression levcl of SIRT1 in the controls and CRSsNP subjects using Western blot

2 CRSsNP黏膜上皮细胞中存在EMT Western blot结果显示，上皮标志物E-cadherin和Occludin在CRSsNP组织中表达相较于正常鼻黏膜组显著减少(P＜0.001)。而CRSsNP黏膜上皮中间质标志物α-SMA、Vimentin和N-cadherin的表达较对照组显著增加(P＜0.001)。与对照组相比，CRSsN P黏膜上皮TGF-β1 mRNA的表达明显升高(P＜0 .001)。见图3。

图3 正常鼻黏膜组织和CRSsNP中EMT相关蛋白和TGF-β1 mRNA表达差异A：Western blot检测正常鼻黏膜组织和CRSsNP中EMT相关蛋白表达情况；B：RT-PCR检测正常鼻黏膜组织和CRSsNP中TGF-β1 mRNA表达情况Fig.3 Protein expression levels of EMT markers and TGF-β1 mRNA expression in the controls and CRSsNP subjectsA: Protein expression levels of EMT markers in the controls and CRSsNP subjects; B: TGF-β1 mRNA expression in the controls and CRSsNP subjects

3 TGF-β1下调人鼻黏膜上皮细胞SIRT1的表达 50 ng/mL TGF-β1分别刺激人鼻黏膜上皮细胞24 h、48 h和72 h，显微镜下观察到随着TGF-β1刺激时间增加，人鼻黏膜上皮细胞间隙逐渐增大，72 h后可见肿胀和死亡的细胞，纤毛数量也随着时间推移逐渐减少直至消失(图4)。同时我们检测人鼻黏膜上皮细胞内SIRT1的mRNA和蛋白表达，发现与对照组相比，TGF-β1刺激24 h、48 h、72 h后人鼻黏膜上皮细胞中SIRT1 mRNA表达均明显下降(P＜0.001)(图5A)。Western blot检测发现SIRT1蛋白的下降趋势呈现时间依赖性，即TGF-β1刺激24 h、48 h、72 h后人鼻黏膜上皮细胞中 SIRT1蛋白表达逐渐下降(P＜0.001)。见图5B。

图4 TGF-β1刺激人鼻黏膜上皮细胞24 h、48 h和72 h后形态变化(白色箭头为纤毛，高倍镜200×)Fig.4 Morphological changes in TGF-β1 induced human NECs(white arrow: cilia, magnification 200×)

图5 TGF-β1下调人鼻黏膜上皮细胞中SIRT1的表达，SIRT1蛋白的下降趋势呈现时间依赖性A：RT-PCR检测TGF-β1分别刺激人鼻黏膜上皮细胞24 h、48 h、72 h后SIRT1 mRNA表达情况；B：Western blot检测TGF-β1分别刺激人鼻黏膜上皮细胞24 h、48 h、72 h后SIRT1蛋白表达情况Fig.5 TGF-β1 downregulated the mRNA and protein expression level of SIRT1 in human NECs in a time-dependent manner A: SIRT1 mRNA expression in the human NECs cultured by treatment with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h; B: SIRT1 protein expression in the human NECs cultured by treatment with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h

4 过表达SIRT1抑制TGF-β1诱导的鼻黏膜上皮细胞EMT Western blot实验的结果显示50 ng/mL TGF-β1诱导48 h后人鼻黏膜上皮细胞中上皮标志物E-cadherin明显减少，而间质标志物α-SMA、Vimentin和N-cadherin的表达明显增加(P＜0.05)。过表达SIRT1可以显著上调E-cadherin表达，降低α-SMA、Vimentin和N-cadherin表达，表明S IRT1对TGF-β1诱导的EMT起抑制作用。见图6。

图6 SIRT1抑制TGF-β1诱导的鼻黏膜上皮细胞EMT转化Fig.6 SIRT1 suppressed EMT induced by TGF-β1 in human NECs

讨 论

上皮组织重塑在CRS的发病过程中有重要作用，主要表现为上皮细胞改变、基底膜增厚、黏膜下组织水肿和纤维增生[13]。而EMT在其中的作用受到越来越多的关注[3,14]。EMT是指上皮细胞在正常生理条件和特定病理条件下发生向间充质细胞表型转化的现象。其起始过程需要外环境中合适的信号介导，TGF-β1在EMT过程中至关重要，其可以诱发呼吸道上皮发生EMT从而参与下气道炎性疾病的发生发展[15-16]。研究发现CRSwNP、CRSsNP黏膜组织中TGF-β1表达均出现明显升高[17-18]，TGF-β1可以通过Smad经典通路和非Smad通路诱导鼻黏膜上皮细胞发生EMT[3,19-20]，本研究中CRSsNP黏膜上皮细胞中发生EMT，同时TGF-β1表达增加，TGF-β1可以诱导人鼻黏膜上皮细胞发生EMT，这与既往报道一致。

研究显示TGF-β1诱导EMT与SIRT1密切相关，TGF-β1可以调节组织细胞中SIRT1的表达水平，而调控SIRT1可以抑制TGF-β1诱导的EMT进程，从而影响多种细胞生物学行为[21-24]。本研究中，CRSsNP黏膜上皮中SIRT1表达减少，提示SIRT1可能在CRSsNP的发生过程中发挥作用。SIRT1调控EMT具有正负双重机制。正性调控机制可能为SIRT1作用于MBD1、Twist和Zeb1等基因，减弱E-cadherin启动子活性从而降低E-cadherin的表达，可以促进胰腺炎、前列腺癌、胰腺癌等上皮细胞EMT。负性保护机制可能为SIRT1通过去乙酰化Smad4抑制TGF-β1/Smad信号通路，继而抑制MMP7的转录和E-cadherin的降解，从而抑制口腔鳞癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤和心、肝、肺、肾等器官上皮细胞EMT[9]。本研究发现TGF-β1下调人鼻黏膜上皮细胞中SIRT1蛋白表达，同时促进EMT，过表达SIRT1可以抑制TGF-β1诱导的人鼻上皮细胞EMT，说明SIRT1对人鼻黏膜上皮细胞的EMT可能有负性保护作用。Lee等[5]发现SIRT1在CRSsNP中增加，而在CRSwNP中减少，细胞和动物实验揭示SIRT1可能通过下调HIF-1α的活性抑制EMT，在鼻息肉的形成中起拮抗保护作用。Yang等[25]则报道CRSwNP、CRSsNP黏膜上皮中均出现SIRT1下调，在CRSwNP中表达的尤为明显，miR-155靶向抑制SIRT1从而拮抗TGF-β1诱导的人鼻黏膜上皮细胞EMT。这些报道与我们的研究是相互验证的。

综上所述，我们的实验结果初步证实SIRT1在CRSsNP的黏膜上皮细胞中低表达，其对TGFβ1诱导的人鼻黏膜细胞EMT起抑制作用，提示SIRT1可能参与CRSsNP发生发展的病理生理过程。但SIRT1的具体作用机制及调控靶点还有待后续进一步研究。