龙眼DlAGOMEL1基因的克隆表达及亚细胞定位分析

陈荣珠，王小平，林美珍，赖钟雄

（1. 漳州卫生职业学院药学系，福建 漳州 363000；2. 福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】龙眼（Dimocarpus longanLour.）是无患子科龙眼属的常绿乔木，主要分布于我国热带及亚热带地区，因其果肉富含营养物质及维生素，是药食两用的佳品，素有“北人参南桂圆”的美称。龙眼胚胎发育的情况关系到其果核大小、坐果率、果实品质及产量，龙眼胚胎发育、果实品质和遗传调控的研究是目前龙眼研究的热点[1]。【前人研究进展】研究表明植物体胚发生过程中基因表达的时空特异性，不仅受特异的DNA序列调控，还受表观遗传调控，尤其是DNA甲基化修饰[2-4]。一定程度的DNA甲基化水平有利于植物体胚的正常发育，相对于非胚性愈伤组织，较低水平的DNA甲基化水平使胚性愈伤组织有更多的基因处于活跃转录状态，从而保证植物胚胎发生能力的实现[5-6]。在水稻研究中发现AGO、DCL和RDR蛋白共同参与DNA甲基化，调控其体胚的发生[7]。其中Argonaute（AGO）蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的蛋白家族，其家族成员生物学功能多样，如参与RNA诱导沉默途径[8]，能与不同类型的小RNA结合并对对靶基因进行切割，在顶端分生组织干细胞的分化过程中具有维持作用，对病毒具有防御拮抗作用，参与DNA甲基化途径[9-10]。拟南芥AGO5（AtAGO5）是水稻MEL1的同源基因，可能参与DNA甲基化和染色质修饰，被认为在配子发生过程中起作用[11]。水稻AGOMEL1能调节孢子体生殖细胞发育和减数分裂，MEL1功能缺失会导致水稻孢子母细胞在减数分裂早期发生异常，阻碍染色体凝聚，从而导致种子完全不育[12]。【本研究切入点】目前仅有少量关于AGOMEL1基因的功能研究，本课题组研究发现，龙眼AGO基因家族中DlAGO4、DlAGO6、DlAGO10在龙眼体胚不同发育阶段中均有不同程度的表达[13-15]，但龙眼AGOMEL1的功能尚不清楚，该基因是否参与龙眼体胚发生过程的调控也未见报道。【拟解决的关键问题】本研究基于龙眼基因组数据库，从中鉴定出龙眼基因组中AGO基因家族含有10个成员[16]，借助龙眼体胚发生系统，以龙眼DlAGOMEL1为目的基因，采用RT-PCR对其CDS及5′端上游启动子序列进行克隆，对该基因的亚细胞定位进行研究，并明确其在龙眼体胚发生过程中的表达模式，为后续该基因的功能研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

龙眼红核子品种体胚发生不同阶段的材料：非胚性愈伤组织（NEC）、愈伤组织（EC）、不完全胚性紧实结构（IcpEC）、球形胚（GE）和子叶形胚（EC）[17]。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA、DNA提取及cDNA逆转录 采用Tripue（Transgen，China）试剂盒对其总RNA提取，提取完的RNA浓度用核酸微量检测仪（Thermo Fisher，USA）检 测。分 别 用SMARTer RACE 5′/3′Kit和YEASEN反转录试剂盒（Hifair® Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR）进行RT-PCR和qRTPCR逆转录。龙眼胚性愈伤组织的DNA提取采用传统的CTAB法。

1.2.2 龙眼DlAGOMEL1基因CDS序列的获取与验证 从龙眼基因组数据库提取DlAGOMEL1基因的CDS序列，用在线软件Primer3.0设计特异性引物（表1），引物序列委托上海铂尚生物技术有限公司合成。以龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板，进行该基因CDS序列的扩增。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用GeneJET Plasmid Miniprep Kit（ThermoScientific，USA）回收目的片段。将回收产物连接转化后并进行菌液PCR验证，最后选择阳性克隆子委托上海铂尚生物技术有限公司测序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 生物信息学分析 DlAGOMEL1蛋白的生物信息学分析包括信号肽、跨膜结构域、磷酸位点、糖基化位点、蛋白质保守结构域、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、氨基酸多序列比对、分子系统进化树、启动子顺式作用元件分析，具体分析方法及网站参照陈荣珠论文中的分析方法[18]。

1.2.4 实时荧光定量PCR 用DNAMAN6.0软件设计特异性引物，以EIF-4a、EF-1a和Fe-SOD为内参基因，用Roche LightCycler 480进行qRT- PCR[19]。使用Excel、SPSS19.0和GraphPad Prism 5进行数据处理、分析和图像绘制。

1.2.5 融合表达载体的构建及亚细胞定位分析 首先对DlAGOMEL1的CDS序列进行限制性内切酶分析，用primer 5设计上下游引物，进行带有Eco31I酶切位点的PCR扩增。挑选阳性克隆子送铂尚生物（上海）有限公司测序，提取质粒DNA。用Eco31I单酶切带有酶切位点的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300载体，回收纯化载体片段和目的基因片段。将酶切后的目的片段和载体片段连接过夜，转T1大肠杆菌感受态，然后涂LB板（添加Kan）过夜培养，挑选阳性克隆子送测，扩繁菌液后进行重组质粒的提取，用Eco31I酶切pCAMBIA1300-DlAGOMEL1-35S-GFP进行酶切验证。用冻融法将重组质粒及空载体转化EHA105农杆菌，然后用农杆菌介导法注射侵染洋葱内表皮并进行GFP荧光观察。

2 结果与分析

2.1 龙眼DlAGOMEL1基因CDS和启动子的克隆及融合表达载体的构建

以龙眼胚性愈伤组织cDNA为模板，DlAGOMEL1-CF和DlAGOMEL1-CQ为上下游引物，进行DlAGOMEL1基因CDS的PCR扩增，电泳图如图1-A所示。将测序结果与基因组序列进行比对，序列完全一致，最后获得该基因CDS序列全长为2655bp。以龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，以pro-AGOMEL1-F和pro-AGOMEL1-R为特异性引物，克隆获得DlAGOMEL1基因5′端上游启动子序列长度为1512bp（图1-B）。

对克隆获得的DlAGOMEL1CDS序列进行限制性内切酶分析，发现DlAGOMEL1未被Eco31I酶切割。利用Primer5.0软件在酶切位点计上下游设计引物，克隆获得带酶切位点的产物，用Eco31I单酶切带有酶切位点的DlAGOMEL1和pCAMBIA1300，最后进行融合表达载体构建（图1-C）并对融合表达载体进行酶切验证。

图1 龙眼DlAGOMEL1基因CDS和启动子序列PCR扩增及融合表达载体的构建Fig. 1 Electrophoretograms of CDS of DlAGOMEL1 and promoter by PCR and fusion expression vector in longan

2.2 生物信息学分析

2.2.1 DlAGOMEL1蛋白的基本性质分析 信号肽预测结果显示，DlAGOMEL1蛋白不含有信号肽，因此是一个非分泌蛋白。跨膜结构预测结果表明，DlAGOMEL1蛋白含有1个显著的由内向外跨膜螺旋结构域，位于434～452 aa，长度为19个氨基酸，其值为821，因此，DlAGOMEL1蛋白的跨膜模型可能为N-末端向内向外。磷酸化和糖基化位点预测结果表明，DlAGOMEL1蛋白含有86个磷酸化位点（Ser:49，Thr:28，Tyr:9），4个糖基化位点。二级结构预测发现，DlAGOMEL1占比最多为无规则卷曲（44.12%），其次为α-螺旋（35.97%），β-折叠占比最少，仅为3.51%，并对该蛋白进行三级结构预测，结果与二级结构的预测结果一致（图2）。利用SMART对DlAGOMEL1蛋白保守结构域进行分析，结果如图3所示，该蛋白含有N-末端、DUF1785、PAZ、ArgoL2、Mid和Piwi保守结构域。

图2 龙眼DlAGOMEL1蛋白三级结构预测Fig. 2 Predicted tertiary structure of DlAGOMEL1

图3 龙眼DlAGOMEL1蛋白保守结构域预测Fig. 3 Predicted functional domains of DlAGOMEL1

2.2.2 龙眼DlAGOMEL1基因编码蛋白的同源性分析 将龙眼AGOMEL1基因编码的氨基酸序列提交NCBI-blastp比对，结果表明，龙眼AGOMEL1与以下9种植物具有较高的同源性，分别为漾濞槭（Acer yangbiense）、蜜柑（Citrus unshiu）、阿月浑子（Pistacia vera）、银白杨（Populus alba）、克莱门柚（Citrus clementina）、胡 杨（Populus euphratica）、毛 果 杨（Populus trichocarpa）、甜橙（Citrus sinensis）、蓝花耧斗菜（Aquilegia coerulea）。再利用DNAMAN 6.0软件将龙眼等以上10种植物的AGOMEL1的氨基酸序列进行多序列比对，结果如图4所示，显示该基因在多种物种中高度保守。

图4 AGOMEL1基因编码氨基酸多序列比对Fig. 4 Multiple sequence alignment of AGOMEL1

2.2.3 系统进化树分析 根据NCBI数据库中胡杨、苹果、甜橙、水稻、玉米等10多条AGOMEL1氨基酸序列，采用Mega5.05软件的Neighbor-Joining构建核苷酸序列的分子系统进化树（P-distance法），并用bootstrap法（重复1000 次）评估系统进化树。结果如图5所示，根据种属进化树的关系可知，龙眼DlAGOMEL1与双子叶植物胡杨AGOMEL1的亲缘关系最近，与单子叶玉米、水稻等AGOMEL1的亲缘关系最远。

图5 AGOMEL1蛋白系统发育进化树Fig. 5 Phylogenetic analysis on DIAGOMEL1 from longan and other plants

2.2.4 龙眼DlAGOMEL1基因的启动子顺式作用元件预测 将克隆获得的DlAGOMEL1基因的启动子序列提交至Plantcare在线预测网站进行顺式作用元件预测，结果表明，该序列除了含有多个TATA-box和CAAT-box核心启动子元件外，还含有响应脱落酸的ABRE元件、大量的光响应元件（Box 4、G-Box等）、高温和低温响应元件、与分生组织表达相关的CAT-box顺式作用调控元件（表2）。

表2 龙眼AGOMEL1基因启动子序列顺式作用元件Table 2 Cis-acting elements of DlAGOMEL1 promoter

2.3 龙眼体胚发生过程中DlAGOMEL1基因的表达情况

为探究DlAGOMEL1基因在龙眼体胚发生的调控作用，利用实时荧光定量PCR仪检测该基因在龙眼体胚发生不同阶段的mRNA转录水平，结果如图6所示。DlAGOMEL1基因在龙眼体胚发生不同时期的相对表达量变化较大，先下降后上升，呈“V”字型，非胚性愈伤组织阶段（NEC）的相对表达量较高，随着体胚的发育，其表达水平降低，到球形胚时期最低，接着又急剧上升，在子叶胚时期（CE）其相对表达量最高，呈显著差异。相对表达量的显著差异表明，DlAGOMEL1在龙眼体胚发生晚期阶段可能发挥重要的调控作用。

图6 龙眼体胚发生不同阶段DlAGOMEL1的相对表达量Fig. 6 Relative expressions of DlAGOMEL1 at different somatic embryogenesis stages of longan

2.4 龙眼DlAGOMEL1基因的亚细胞定位分析

参照文献[20]的方法对重组质粒pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP及pCAMBIA1300-35s-GFP进行农杆菌的转化及筛选，然后将菌液注射到洋葱内表皮，置于28 ℃的培养箱中暗培养3 d，以注射pCAMBIA1300-35s-GFP的洋葱内表皮为对照，用荧光共聚焦显微镜观察绿色荧光信号。结果显示，转入空载的洋葱内表皮细胞，荧光分布于整个细胞，而加入DlAGOMEL1的重组载体转入洋葱内表皮细胞，荧光只分布于细胞质中，表明该基因定位于细胞质中（图7-A～C），可能在细胞质中发挥功能作用（图7-D～F）。

图7 pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP蛋白在洋葱内表皮细胞的亚细胞定位Fig. 7 Subcellular localization of pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP protein in onion

3 讨论与结论

Argonaute（AGO）蛋白是一类RNA结合蛋白，在小RNA介导的基因沉默中起关键作用，该蛋白在真核生物中高度保守，主要含有典型的保守结构域，包括N-端、PAZ、Mid、Piwi[11]。目前，AGO蛋白家族在植物中的研究越来越多，而关于AGOMEL1的研究报道还较少，尤其未见在龙眼体胚中有报道。本研究以筛选鉴定出的龙眼AGO基因家族为基础，克隆获得了长度为2655 bp的DlAGOMEL1基因CDS全长序列，编码884个氨基酸。同时，对该基因进行了生物信息学分析发现，DlAGOMEL1蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白，含有跨膜结构域，富含苏氨酸和丝氨酸的磷酸化修饰位点，推测该蛋白可能以蛋白磷酸化方式参与调控植物细胞的生长发育。龙眼AGOMEL1蛋白含有PAZ、Mid和Piwi 3个典型的保守结构域，PAZ结构域中含有β-桶亚结构域，该亚结构域可识别结合非特异单链核酸中3′端突出的2个碱基[21]；位于C端具有内切酶活性的Piwi结构域，能特异性地结合小RNA 5′-磷酸末端[11]，其含有一个保守的DDH/H motif催化三联体中心，即D760、D845、H986和H798，因此具有切割活性，而分析发现AGOMEL1蛋白的Piwi结构域中H986缺失，为DD./H，推测该蛋白可能不具有切割活性。上述结果说明，DlAGOMEL1基因的生物学功能可能与其结构具有密切的关系。

AGO基因在植物的生长发育、抗逆胁迫、配子体形成和发育及DNA修复中发挥着重要的功能。水稻OsAGOMEL1能与5′末端为C的 21-nt siRNA结合，调控配子减数分裂前期的细胞分裂，但MEL1与siRNAs结合对生殖细胞发育的作用机制还需深入研究[14-15]；在雄配子体的形成、成熟与传递过程中，MET1、DRM2、ROS1、DME和DDM1表达并一直保持到营养核和精细胞分化的三核花粉期，导致染色质的修饰状态改变[22]。但是，DlAGOMEL1在龙眼体胚发生过程的作用未见报道，本研究利用qRT-PCR检测其相对表达情况，结果发现该基因在龙眼体胚发生过程中先下降后上升，且在子叶胚时期有最高的相对表达量，由此推测，DlAGOMEL1可能与龙眼体胚发生的晚期密切相关，但是该基因在龙眼体胚发生过程中的调控作用有待进一步深入研究。

探究蛋白质在细胞中的定位可进一步系统性地了解该基因的生物学功能[23]。GFP作为基因表达的常见报告因子，其具有易检测、高灵敏度及荧光性质稳定[24]等特点，在越来越多的物种中被用于研究蛋白的亚细胞定位。关于不同物种AGOMEL1及其同源基因AGO5的亚细胞定位已有一些研究报道，番茄SlAGO5定位于核膜中[25]；水稻OsAGOMEL1主要定位于生殖细胞的细胞质中[11]，参与调控孢子体生殖细胞发育和减数分裂过程；在玉米中发现，AGOMEL1基因定位于细胞质中，参与小孢子期花粉的形成，在生殖细胞中破坏MEL1稳态导致phasiRNA靶基因脱靶分裂[14]；龙眼DlAGO5主要定位在细胞核[26]。本研究发现，龙眼DlAGOMEL1虽与DlAGO5在进化树处于同一分支，但其定位于洋葱内表皮细胞的细胞质中，该基因在龙眼中的生物学功能是否与单子叶植物水稻和玉米一样参与调控减数分裂过程有待进一步研究。

本研究克隆获得了龙眼DlAGOMEL1基因的CDS序列及5′端启动子序列，并对其进行了生物信息学分析。结果表明，龙眼DlAGOMEL1蛋白含有保守结构域PAZ、Mid和Piwi，该蛋白含有大量的磷酸化位点及多个糖基化位点，与胡杨相似度最高。相对表达量分析结果表明，DlAGOMEL1在龙眼子叶胚时期可能发挥重要的调控作用。亚细胞定位表明，龙眼DlAGOMEL1基因定位于细胞质中。对该基因启动子序列顺式作用元件进行分析，结果表明，该序列含有多个脱落酸响应元件和大量光响应元件及温度响应元件等，推测该基因的表达模式可能受外源激素、光及温度等的影响。该研究结果为进一步探究AGOMEL1基因在龙眼体胚发生过程的作用提供了参考，也为龙眼分子育种提供了理论依据。