杂交稻广优673高产栽培因子优化与抗瘟性分析

李福德

（福建省安溪县农业农村局，福建 安溪 362400）

0 引言

1 材料与方法

1.1 试验概况

试验在安溪县长坑乡玉美村实施，试验点海拔637 m，土壤为弱酸性砂壤土，肥力中等，pH值5.8，有机质29.2 mg·kg-1，全氮1.33 mg·kg-1，水解氮138 mg·kg-1，有效磷44.5 mg·kg-1，速效钾58.5 mg·kg-1。每个小区建立小田埂，并用地膜进行完全覆盖，防止不同小区之间肥水互相串流。中稻种植，前作春种马铃薯，4月21日进行播种；每穴插 1～2株；各处理统一施过磷酸钙360 kg·hm-2，KCl 145 kg·hm-2，施基肥量为总施 N量的40%左右，P2O5的60%，K2O的70%；施分蘖肥为总N的40%，P2O5的40%。穗肥为总N的20%，K2O的30%。施用的氮肥基肥为碳酸氢铵，蘖肥和穗肥为尿素，磷肥为过磷酸钙，钾肥为氯化钾 。移栽后7 d施入分蘖肥，进入幼穗分化2～3期进行穗肥喷施。生长期间，防治2次三化螟、1次卷叶螟、1次纹枯病，未发生稻瘟病。9月10日收割。

1.2 栽培因子优化试验

1.2.1 试验方案 以种植密度、田间施氮量、苗期秧龄为试验因素，以水稻种植产量为目标函数，用最优回归设计[8-9]，选用“3l1-A”方案，具体的因素水平及编码见表1。小区面积 13.34 m2（2 m×6.67 m），设置2次重复 ，共22个不同小区，每个区组内均按照随机排列进行种植[8]。

表1 因素水平及编码Table 1 Code and levels of factors

1.2.2 田间性状记载 生长期间，详细记载播种期、移栽期、齐穗期、成熟期、收割期以及其他具体农事活动。水稻成熟后，各小区采用五点取样法选取5丛考种，先割去各小区的边行，然后各小区实割，并进行称湿谷重，各小区保留湿谷2.5 kg，然后晒干，称干谷重，计算晒干率，最后折算小区干谷重，并进行数据分析。

1.3 稻瘟病抗性分析

1.3.1 DNA 提取 水稻基因组DNA的提取采取以下方法：①TPS抽提液置于75 ℃水浴中预热；②新鲜叶片加液氮磨碎，加入1 mL TPS抽提液，75 ℃水浴30 min，并震动；③12000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，加入等体积的异戊醇并混匀，静置20 min；④12000 r·min-1离心10 min，弃上清，DNA 沉淀用75%的乙醇洗涤2次，并晾干；⑤加入200～300 μL超纯水溶解。

1.3.2 PCR扩增及电泳分析 PCR反应体系20 μL：2×TaqMix 10 μL，DNA模板2 μL，前引物1 μL，后引物1 μL，水6 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min，33个循环（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离，主要分为4个步骤：①制胶，6%聚丙烯酰胺变性凝胶；②点样，待胶完全凝固后，取1.5 μL样品注入点样孔；③电泳，调节电压至110 V，电泳时间约为0.5 h；④染色，用核酸染料进行染色，利用凝胶成像系统进行拍照观察。

1.3.3 稻瘟病抗性基因检测引物 稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9和Pigm检测标记参照田大刚等[9]的方法。前引物：CTTATTTCGTTTGCTATGC，后引物：GGA CTATGTGATCGGTTAG，引物合成由福州博尚生物科技有限公司完成。特异性引物主要依据Pi2、Pi9和Pigm基因内部序列的差异进行设计，检测有132 bp条带的材料含有Pi9基因，检测有164 bp条带的材料含有Pi2基因，检测有132 bp和164 bp条带的材料含有Pigm基因。

2 结果与分析

2.1 广优673的主要特征特性

广优673为三系杂交中籼组合，在安溪县长坑乡玉美村种植，于4月21日播种，5月20日插秧，8月1日始穗，8月5日齐穗，9月10日收割，全生育期143 d，比对照Ⅱ优明86迟熟3 d；取样考种结果，株高112 cm，有效穗数228.6 万穗·hm-2，穗长26.2 cm，每穗总粒数183.5 粒，结实率86.8%，千粒重31.5 g。广优673参加福建省区试2年稻瘟病抗性鉴定结果综合评价为中抗（MR）。广优673的米质表现较一般，根据农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心检测结果：糙米率81.0%，精米率73.0%，整精米率42.2%，粒长7.2 mm，垩白粒率79%，垩白度13.6%，胶稠度84 mm，碱消值5.2级，透明度2级，直链淀粉含量20.5%[10]。

2.2 回归模型分析

2.2.1 建立回归模型 根据实际收割的产量（表2），利用DPS软件进行统计分析，并依据每公顷产量与3个试验处理的回归方程进行分析，回归方程为：

民间非营利组织不属于企业的范畴，也不属于政府机构，是一种公共服务组织，为公民提供服务，具有一定的公益性。民间非营利组织，从某些特定的角度来看，和国有非营利事业单位有一些相似之处，但是仍有许多不同之处。前者更具有民间性，同时非政府性也更加的突出。对于国有非营利事业单位来说，其资金来源与民间非营利组织是不同的，后者具备典型的民间性。第一，民间非营利组织不属于政府部门，属于一种社会组织，并且是独立运营管理的。第二，民间非营利组织在举办一系列活动时，或在运营发展过程中，都不依靠政府拨款，主要的经济来源是通过社会的捐赠，或者是提供服务来收取一些费用等等。

表2 栽培试验的产量结果Table 2 Yield of cultivation experiment

2.2.2 检验回归模型 为了明确回归方程的有效性和准确数，先进行F检验，回归检验的F值为39.70。如果大于F0.01（10，10）=4.85，表明回归方程与实际情况吻合度很好，能够真实反映3项试验措施与水稻产量的综合关系。为了进一步明确各种因子的影响情况，对水稻产量回归方程的偏回归系数进行t检验和分析（表3），检查与分析结果表明，大多数的偏回归系数都达一定的显著水平。

表3 偏回归系数的t值检验Table 3 The t test of partial regression coefficient

2.2.3 不同农艺措施的效应分析

（1）单个农艺措施的效应

依据降维法可以分析出各因素与产量的关系，如果另外2个因素的编码值接近零水平时，可以得出一个因素与水稻产量的偏回归方程[11]，因3个自变量的二次项均为负值，可见3项措施与产量的函数关系呈弯曲度不同的开口向下的抛物线，出现极大值，其值过高或过低均不利于水稻的高产，其最高产量的x1为 0.3140 （24.85万丛·hm-2），x2为 0.3287（纯氮157.19 kg·hm-2），x3为-0.3225（32 d）。

（2）农艺措施之间互作效应分析

根据回归方程分析结果可知，各个因素之间存在相互效应；插植密度x1与氮肥施用量x2互作关系不显著（P＞0.05）。插植密度x1与秧龄x3存在显著正互作效应（P＜0.05），说明水稻的秧龄短，早插生长期长，分蘖早且多，插植密度相对小些有利高产，秧龄长的，迟插分蘖发生迟且少，插植密度大些，也可获得高产，以移栽较早，密度中等的产量为高。如果施氮量x2与水稻秧龄x3存在负互作效应（P＜0.01），说明水稻秧龄短的，早插本田生长期长，需要施用较多氮肥，才有利于高产；如果秧龄长的，本田生长期相应会短些，就不需要施用过多的氮肥。

（3）分析和确定高产栽培技术方案

为了寻找水稻高产栽培技术方案，采用统计选优法，以水稻产量为目标函数进行分析。首先确定产量的预定指标，在限制不同条件下，3个因素分别取5个水平进行分析，并按照一定步长，在微机上模拟试验，通过不断改变步长和取值的范围，一直到5个水平上不同的模拟值都达到预定目标时，就将该取值范围设置为预定指标理想的取值区域[12]，再经过微机模拟分析，产量≥8250 kg·hm-2的平均值：每公顷插24.00万丛，施纯N量 164.23 kg，秧龄29.5 d（表4）。

表4 每公顷产量 ≥8250 kg 措施分布范围Table 4 Distribution range of factors when yield ≥8250 kg·hm-2

2.3 广优673稻瘟病抗性分析

广优673在福建省安溪县引种示范种植，稻瘟病表现较强抗性。为了进一步分析其抗性的位点，利用稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9和Pigm检测标记，对广优673、日本晴、9311和CO39进行检测分析。检测结果显示，对照感病材料日本晴、9311和CO39均没有检测到抗性基因标记条带，而广优673检测有稻瘟病抗性基因Pi2条带（图1）。结果表明，广优673的抗性很可能来源于Pi2基因的抗性。

图1 抗稻瘟病基因的分子标记检测Fig. 1 PCR analysis for rice blast resistance genes

3 讨论与结论

3.1 广优673栽培技术分析

广优673产量水平高，尤其适合在中高海拔山区作中稻、单季稻种植。根据产量构成情况分析，该品种主要的增产因素是千粒重大，穗粒数较多，结实率较高。此外，广优673还表现耐寒性好，适合山区冷浸田种植；但是，该品种在某些性状上还是存在一些不足，主要是稻米品质一般，垩白粒率较高，垩白度大，整精米率偏低，植株也相对偏高。

试验结果表明，密度、秧龄、N肥用量3个因素对广优673的产量都会有影响，结合生产实际，广优673在福建省安溪县作中稻种植，高产栽培应掌握每公顷插23.0万丛左右，移栽秧龄为28～30 d，施纯N量为165 kg·hm-2左右。同时兼顾其他配套的栽培技术，如稀播育壮秧，施足基肥，早施分蘖肥，促早生快发，中后期适量增施穗粒肥，并适时断水烤田，促进籽粒成熟，才能更加有利于产量的形成，确保高产。

3.2 广优673稻瘟病抗性基因分析

广优673在2年的福建省区试中均表现较好的稻瘟病抗性，在安溪县引种种植也表现较好的稻瘟病抗性。推测广优673稻瘟病的抗性表现不是由于栽培技术的影响和环境的影响，而是由于广优673自身遗传因素。为了进一步鉴定广优673稻瘟病抗性基因来源，利用开发的分子标记进行检测，结果表明广优673含有抗稻瘟病Pi2基因。

Chen等[13]研究表明Pi2 的抗谱很广，对从中国收集的792个稻瘟小种中的绝大部分表现抗性，只有7.55%的小种能侵染携带Pi2 的亲本C101A51。此外，Pi2 对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性[14]。Pi2 属于NBS-LRR类基因，含有2个内含子，长度分别是3839 bp 和116 bp，Pi2 编码产物包含1032个氨基酸，属于典型的抗病R蛋白[15]。Piz-t、Pi9、Pi2和Pigm互为Piz位点上的等位基因[7,16]。另外，我们已经将安溪县种植感病水稻品种的叶片取回，目前正在进行稻瘟病菌的分离，后期将利用分离的不同稻瘟病菌，对广优673和携带Pi2的单基因系进行接种，来进一步确定广优673的抗谱特征和抗性来源。

利用分子标记检测表明广优673含有抗性基因Pi2，然而广优673可能还含有其他抗性基因。杨德卫等[7]研究利用生物信息学分析表明，感病品种日本晴中含有523个稻瘟病抗性R基因。实际上，每个品种都含有多个抗病基因，有的品种含有抗性基因的数量多，有的数量少，有的品种含有抗性基因的抗谱广，有的抗谱窄。鉴于目前稻瘟病抗性基因标记数量有限，本研究利用目前抗性较强的Pi2[15]、Pi9[17]和Pigm基因功能标记[16]，检测广优673含有稻瘟病抗性基因Pi2，而不含有稻瘟病抗性基因Pi9和Pigm，推测广优673抗性可能来源于抗性基因Pi2。