环境胁迫对清香型白酒发酵核心微生物生长的影响

杨 埔，蔚慧欣，张 鑫，王鹏然，甄 攀，张丽珍2，，韩 英

（1.山西杏花村汾酒厂股份有限公司，山西汾阳 032209；2.山西大学杏花村学院（山西酿造产业研究院（筹）），山西太原 030006；3.山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

清香型白酒是中国白酒三大基本香型之一，其产品风格突出“清香、柔和、劲爽、舒适”的特点[1]。传统清香型白酒的发酵过程包括2 个阶段，即大米查发酵和二米查发酵。一般来说，在清香型白酒的发酵过程中，酒醅理化性质会随着发酵时间的变化而变化。酒醅温度呈现先升高，后降低的趋势。起始温度为10～20 ℃，顶火温度可以达到30 ℃以上，最终保持在22～25 ℃，直到发酵完成[2-3]。在整个发酵阶段，酒醅酸度持续升高[3]，pH 值呈现下降的趋势[2]。而乙醇产量在7～14 d达到最高，此后保持基本稳定[2-3]。

酿酒过程本质上就是微生物的代谢过程。一般来说，霉菌在发酵之初起到糖化作用，其代谢产生的寡糖或单糖可以被酵母菌直接利用产生酒精。而细菌主要产生白酒风味物质及其前体物质（如有机酸），起增香提味的作用[4-5]。利用高通量测序技术对清香型白酒酿酒过程中微生物群落结构的研究表明，酒醅中真菌和细菌群落组成复杂，并且随着发酵过程而变化。其中，酵母属和复膜孢酵母属是优势真菌，而乳杆菌属、片球菌属是优势细菌[5]。

微生物的生长代谢受到多种环境条件的影响，如温度、氧气、pH 值。在清香型白酒发酵的中后期，随着乙醇和有机酸（如乙酸、乳酸）含量的上升，这些环境胁迫不可避免的会对酿酒微生物的生长代谢造成影响。虽然通过高通量测序技术可以获得酒醅发酵微生物的演替规律，但是却无法阐明微生物演替的机制。鉴于此，本项目将以分离自酒醅的核心纯种微生物为研究对象，分析环境胁迫（乙醇、乙酸、乳酸）对这些微生物生长的影响。本研究有助于阐明白酒发酵过程中微生物演替的规律，并可以为白酒发酵工艺的改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

酿酒酵母和产酸菌由本实验室分离自汾阳市某酒厂并保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 培养基与试剂

MRS 培养基购自北京索莱宝科技有限公司，调整pH5.5后，115 ℃灭菌30 min。

YPD 培养基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，麦芽糖20 g，蛋白胨20 g，水1 L，pH 5.5。固体培养基中加入15 g/L琼脂。115 ℃灭菌30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 环境胁迫对酵母菌生长的影响

采用固体平板法分析酵母菌对环境胁迫的耐受性。在YPD 固体培养基中分别加入不同浓度的乳酸（0.5%v/v、1%v/v、2%v/v、4%v/v 和8%v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v 和2 %v/v）或乙醇（4 %v/v、8% v/v、12 %v/v、16 %v/v和20%v/v）后倾倒平板，再用灭菌枪头分别挑取纯种酵母菌的单菌落，接种于上述固体培养基，30 ℃培养72 h后观察菌株是否生长。

1.2.2 环境胁迫对产酸菌生长的影响

采用固体平板法分析产酸菌对环境胁迫的耐受性。在pH5.5 的MRS 固体培养基中分别加入不同浓度的乳酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v、2 %v/v 和4 %v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25%v/v、0.5%v/v、1%v/v、2%v/v 和4%v/v）或乙醇（4 %v/v、8 %v/v、12 %v/v、16 %v/v 和20 %v/v）。然后用灭菌枪头分别挑取纯种产酸菌的单菌落，并将其接种于上述固体培养基，35 ℃培养120 h 后观察菌株是否生长。

2 结果与分析

2.1 酵母菌对乳酸的耐受性

酵母菌对乳酸的耐受性结果如图1 所示。所有的酵母菌都可以在含有2 %乳酸的YPD 培养基上生长。大部分酵母菌（62/64）对4 %乳酸具有耐受性；只有1 株酵母菌可以在含有8 %乳酸的培养基上生长，但是菌落较小。

图1 酿酒酵母对乳酸的耐受性

2.2 酵母菌对乙酸的耐受性

酵母菌对乙酸的耐受性结果如图2 所示。大部分酵母菌可以在含有0.125 %（64/64）、0.25 %（63/64）和0.5%（57/64）乙酸的培养基上生长。1株酵母菌可以在含有1 %乙酸的培养基上生长。所有的菌株都不能在含有2%乙酸的培养基上生长。

图2 酿酒酵母对乙酸的耐受性

2.3 酵母菌对乙醇的耐受性

酵母菌对酒精的耐受性结果如图3 所示。有61 株（95.3%）酵母菌可以耐受20%乙醇，另外3 株酵母菌只能耐受8%的乙醇。

图3 酿酒酵母对乙醇的耐受性

2.4 产酸菌对乳酸的耐受性

产酸菌对乳酸的耐受性结果如图4 所示。所有产酸菌都可以在不含乳酸的MRS 固体培养基上生长。随着乳酸浓度的增加，产酸菌的耐受性逐渐降低。只有1 株产酸菌对0.125 %乳酸敏感，而只有6 株（11.3%）产酸菌可以在含有1%乳酸的培养基上生长，2 株菌可以耐受2%乳酸。4%乳酸能抑制所有产酸菌的生长。

图4 产酸菌对乳酸的耐受性

2.5 产酸菌对乙酸的耐受性

产酸菌对乙酸的耐受性结果如图5 所示。在阳性对照中，所有的产酸菌都可以生长，有46 株（86.8 %）产酸菌可以耐受0.125 %乙酸，34 株菌可以耐受0.5%乙酸；但是只有6 株（11.3%）产酸菌可以耐受1%乙酸，2 株（3.8%）菌可以耐受2%乙酸，所有菌株都不能在4%乙酸培养基上生长。

图5 产酸菌对乙酸的耐受性

2.6 产酸菌对乙醇的耐受性

产酸菌对乙醇的耐受性结果如图6 所示。只有6 株（11.3%）产酸菌对12%乙醇敏感，而有18 株（34.0%）产酸菌可以耐受20%乙醇。

图6 产酸菌对乙醇的耐受性

3 讨论

在白酒发酵过程中，微生物代谢活动产生了种类繁多的代谢产物。其中，酿酒酵母是最主要的酒精产生菌[6]，乳酸菌的主要功能是产生乳酸和乙酸[7]，而己酸菌，如梭菌属、瘤胃菌科、巨球型菌属、芽孢杆菌属，则可以产生己酸[8]。随后，毕赤酵母可以将有机酸和乙醇转化为酯类[9]。这些物质构成了白酒中最主要的呈香物质。目前的研究也主要集中在这些风味物质的功能上。然而，当乙醇、有机酸等物质含量过高时，也会抑制微生物的生长。这些环境胁迫对酿酒核心微生物生长代谢的影响，尚无系统的研究与报道。

研究显示，随着培养基中乳酸浓度的升高，乳杆菌细胞分裂变慢，代时延长，细胞体积和长度均变小[10]。有机酸在未解离状态下是脂溶性的，可以通过自由扩散透过微生物细胞膜进入胞内，从而对微生物细胞产生毒害[11]；而解离部分会造成胞内pH 值的变化，进而影响DNA 的合成等过程，最终影响细胞生长[12-13]。因此，有机酸可以被用于食品防腐[11]。在传统白酒发酵的中期，酒醅中的乙酸含量可达0.1 %～0.15 %[14-15]，而乳酸含量为0.6 %～1 %[14，16]。在该条件下，所有的酵母菌和一部分产酸菌（0.125 %乙酸，45/53；1 %乳酸，6/53）可以生长。而在发酵第28 天，酒醅中乙酸、乳酸含量分别达到了0.3%～1.7%[14-15]和1.2%～1.9%[14，16]，此时的乙酸浓度会严重抑制所有酵母菌和大部分产酸菌的生长，而乳酸浓度会抑制产酸菌的生长，但是几乎不会抑制酵母菌的生长。

乙醇不仅会影响微生物细胞膜组成、结构和流动性[17]，而且会导致DNA 复制速率的降低和DNA突变速率的增加[18]。在传统白酒的发酵过程中，酒醅中乙醇的含量可达10%以上，而在控温发酵中，乙醇含量可以达到20%[3]。本实验的结果证实，大部分（61/64）酵母菌和一部分产酸菌（18/53）对高浓度（20%）乙醇表现出耐受性。

在传统发酵过程中，前期是产酒精过程，酒醅中酒精含量在7～14 d 即达到最高。然而，此时环境中的乙醇和有机酸并不影响酵母菌的生长。因此，酒精生成的停滞可能是其他环境条件引起的。而后期是产酸产酯的过程，产酸菌的生长并未受到抑制，并且产酸过程也可以持续发生。因此，环境因素影响酵母菌酒精产量的原因和机制，将是下一步的研究重点。