超声造影定量分析大鼠肝缺血再灌注损伤的实验研究

南格利 阮欣宇 王 柳 刘 洁 段麦叶 王 莉 王 欢

肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是指肝脏缺血一段时间后血流再灌注时引发的一系列炎症反应、代谢紊乱、氧自由基生成等造成的肝实质损伤［1-2］。目前临床诊断HIRI 的方法主要有病理检查、MRI 和肝功能检测等，但均有其局限，其中病理检查虽为诊断HIRI的金标准，但其具有创伤性，可能对肝脏造成损伤［3］。因此，寻求一种更为安全、有效的检测方法极为重要。超声造影通过静脉注射造影剂显示病变的血液循环情况，从而评估病情，克服了常规超声对低速血流敏感性差的不足［4］。本实验通过探讨超声造影在大鼠HIRI 病情评估中的应用价值，旨在为临床提供参考依据。

材料与方法

一、实验动物与分组

雄 性 SD 大 鼠 49 只 ，体 质 量 170~210 g，平 均（192.16±10.21）g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司［动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016］。49 只大鼠中，因麻醉、术中出血过多及未到设定再灌注时间点意外死亡7 只，余42 只采用随机数字表法分为7 组，每组各 6 只，分别为假手术组和 HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 6个亚组。

二、实验方法

1.实验动物模型建立：15%水合氯醛（西安天正药用辅料有限公司）腹腔注射麻醉（350 mg/kg）后将大鼠固定于手术台上，腹部至剑突术区备皮消毒，于上腹部正中切口打开腹腔，分离出肝脏左、中叶之肝蒂，使用无创血管夹夹闭肝中叶和左叶处门静脉、肝动脉，阻断血供，止血钳夹闭切口临时关闭腹腔。持续缺血1 h后取出血管夹，再灌注成功后关闭腹腔。假手术组未夹闭门静脉和肝动脉，其余实验方法同上。

2.超声造影检查：使用西门子Acuson S 2000 彩色多普勒超声诊断仪，9L4 线阵探头，频率7~12 MHz；造影剂使用意大利博莱科公司生产的SonoVue，加入5.0 ml 生理盐水稀释后振荡混匀成混悬液备用。常规超声显示肝左叶及腹主动脉切面，然后开启超声造影模式，机械指数0.07，深度、增益等参数在实验过程中保持不变。将0.2 ml超声造影剂混悬液注入大鼠尾静脉，随后注射0.5 ml生理盐水，开启计时器并存储视频90 s。开启对比脉冲序列超声造影后处理软件，脱机处理存储的视频。将感兴趣区（region of interest，ROI）置于肝实质，大小设为5.0~8.0 mm2。软件自动生成超声造影时间-强度曲线（TIC），获取峰值强度（PI）、曲线下面积（AUC）、达峰时间（TP）、平均渡越时间（MTT）等参数。每只大鼠选取3个ROI并重复测量3次取平均值。

3.实验室检查：各组大鼠再灌注后取其下腔静脉血3 ml，置于4℃冰箱保存2 h，3000 r/min 离心15 min，取其上清液于-80℃下保存，应用7600-120 全自动生化分析仪（日本HITACHI 公司）检测谷丙转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。

4.病理检查：取各组大鼠肝左叶组织标本，10%甲醛液固定后切片，HE 染色后置于CX31 光学显微镜（日本奥林巴斯公司）下观察病理组织学改变。

三、统计学处理

应用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以表示，多组比较采用方差分析，两两比较行t检验。相关性分析采用Pearson 相关分析法。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、超声造影检查结果比较

HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组PI、AUC 均低于假手术组，TP、MTT 均高于假手术组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。随着HIRI时间延长，AUC先逐渐降低，于 48 h 时再升高，TP、MTT 先逐渐升高，于48 h时再降低。见表1和图1。

图1 各组超声造影图

表1 各组超声造影定量参数比较（）

表1 各组超声造影定量参数比较（）

与假手术组比较，*P<0.05。PI：峰值强度；AUC：曲线下面积；TP：达峰时间；MTT：平均渡越时间

PI（dB）22.96±1.54 AUC（dB·s）1065.36±48.47 TP（s）27.83±2.05 MTT（s）37.92±2.14 46.85±2.11*45.36±2.98*49.28±3.06*58.43±4.15*62.89±4.56*47.33±2.58*组别假手术组HIRI组0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 15.35±2.14*16.84±2.39*14.56±2.58*12.12±2.28*9.15±1.84*17.95±2.98*952.28±36.64*910.18±40.36*730.48±45.23*672.84±38.25*581.67±37.55*795.39±53.25*31.75±2.74*33.14±3.18*36.23±3.39*44.08±3.84*48.12±4.06*30.15±2.84*

二、实验室检查结果比较

HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组血清 ALT、AST 水平均高于假手术组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。随着 HIRI 时间延长，ALT、AST 水平先升高后下降，在6 h 时达到峰值。见表2。

表2 各组ALT、AST水平比较（） U/L

表2 各组ALT、AST水平比较（） U/L

与假手术组比较，*P<0.05。ALT：谷丙转氨酶；AST：天冬氨酸转氨酶

组别假手术组HIRI组0.5 h 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h ALT 18.36±3.68 AST 19.04±3.85 118.62±9.38*209.17±20.49*342.89±24.67*189.63±15.25*99.35±12.78*80.19±9.52*122.44±10.72*209.56±16.64*248.35±23.51*156.29±14.33*100.64±12.43*75.35±8.62*

三、病理检查结果

假手术组肝小叶结构清晰完整，肝细胞无变性坏死，排列整齐，大小均匀，无中心粒细胞聚集。HIRI 0.5 h 组肝细胞水肿变性，肝窦可见大量红细胞淤积；HIRI 3 h 组肝细胞水肿变性，肝窦可见红细胞淤积，并可见少量中性粒细胞；HIRI 6 h、12 h 组肝小叶结构逐渐发生变化，肝细胞水肿变性，逐渐出现灶性坏死，肝窦可见红细胞淤积减少，中性粒细胞增多；HIRI 24 h组肝小叶结构紊乱，较12 h 肝细胞水肿变性减轻，中性粒细胞增多；HIRI 48 h 组较24 h 组肝细胞水肿变性减轻，中性粒细胞减少。见图2。

图2 各组病理图

四、相关性分析

Pearson相关性分析显示，AUC与血清ALT、AST水平均呈负相关（r=-0.754、-0.808，均P<0.001）；TP与血清ALT、AST水平均呈正相关（r=0.731、0.709，均P<0.001）；MTT 与血清AST 水平呈正相关（r=0.718，P<0.001）；PI与血清ALT、AST水平无相关性。见表3。

表3 超声造影定量参数与血清ALT、AST水平的相关性分析

讨 论

HIRI 是由多细胞、多介质联合作用产生的级联反应，其对机体的损伤程度远大于机体的自我保护系统，可导致肝功能衰竭，甚至其他器官功能衰竭，严重危害患者身体健康［5］。因此，如何准确、快速诊断其病情并及时给予治疗极为重要。目前临床诊断HIRI 的方法主要有病理、MRI 和肝功能指标检测等。其中病理检查是诊断HIRI 的金标准，但其有创，极易对患者肝脏造成损伤。MRI 虽能够明确肝功能的病变性质，提供准确的影像学检查资料，但费用高，且无法实现动态监测。肝功能指标检测能实时监测患者的肝功能损伤程度，但无法提供影像学信息。超声造影通过静脉注射造影剂，造影剂再经肺循环到达各组织的微循环，显示病变的血液循环情况，可对肝内微循环进行无创、可重复性检查，能用于定性诊断肝脏肿瘤、评估肝射频消融疗效等。

本实验结果显示，HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组 PI、AUC 均低于假手术组，TP、MTT 均高于假手术组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结合病理检查结果分析原因为：再灌注0.5 h后肝细胞肿胀导致肝血窦变窄，肝窦内红细胞淤积导致肝窦中无复流，使肝血窦内阻力升高，肝缺血后再灌注缓慢。再灌注3 h后，出现少量中性粒细胞，改善了微循环障碍的通透性，有利于降低肝血窦内阻力，再灌注血流流速增快，灌注量增加。再灌注6~24 h 后，肝细胞水肿加重导致肝窦狭窄，中性粒聚集增多阻塞了肝血窦，导致微循环障碍更严重，影响再灌注。再灌注48 h 后，肝组织结构自我修复能力开始发挥作用，机体代偿逐渐趋于平衡，微循环障碍逐渐得到改善［6-7］。另外，本实验结果显示，HIRI 0.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 组ALT、AST 水平均高于假手术组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。说明HIRI时肝细胞萎缩、坏死，严重影响其肝功能情况，与左嘉玮等［8］研究结果相似。本实验结果显示，随着HIRI 时间延长，血清ALT、AST 水平先升高后下降，于6 h时达到峰值。分析原因为：HIRI的发生表明其微循环已发生改变，使得炎症因子通过血液循环释放于肝脏，导致肝脏进一步受损，此时血清ALT、AST 水平逐渐升高，且于 6 h 时达到峰值［9］；随着HIRI时间的延长，肝功能逐渐恢复，微循环得以改善，故血清ALT、AST水平呈下降趋势。

本实验Pearson 相关分析显示，AUC 与血清ALT、AST水平均呈负相关（r=-0.754、-0.808，均P<0.001）；TP 与血 清 ALT、AST 水 平 均呈 正 相 关（r=0.731、0.709，均P<0.001）；MTT 与血清AST 水平呈正相关（r=0.718，P<0.001）。说明AUC、TP、MTT均能反映肝功能的变化情况，与王双龙等［10］研究结果相似。

综上所述，超声造影能实时、准确地评估大鼠HIRI微循环的变化，对评估HIRI的病情具有一定价值。但本实验仅比较了HIRI 不同时间点超声定量参数和实验室检查结果，今后需进一步探讨随HIRI时间延长微循环的具体变化。