番茄果实成熟软化过程中细胞壁作用机制研究进展

敖 雁，杨淼焱，张 驰，吴 启,*

（1.苏州健雄职业技术学院，江苏 苏州 215411；2.东京大学农学生命科学研究科，东京 113-8657；3.雪城大学，雪城 13244）

番茄（Solanum lycopersicum）果实可为人类提供丰富的营养物质、水分、蛋白质及维生素，但其果实成熟后极易软化，造成腐烂变质。因此番茄果实软化机制及延长其保鲜时间一直是科学家研究的重点课题。作为研究肉质植物果实成熟软化机制的模式作物[1]，番茄果实成熟软化的过程十分复杂，包括一系列的生理生化反应，如细胞壁的降解、呼吸速率以及其他代谢产物的变化等。

植物细胞壁由多种生物复合体组成，是自然界最为复杂的细胞结构之一。事实证明，成千上万的基因参与这一过程。然而，植物细胞壁却仍是植物中了解最少的细胞结构[2]。番茄细胞壁主要是由果胶、纤维素、半纤维素和糖蛋白等相互交错形成的复杂网络结构[3]，而细胞壁的水解作用更是造成番茄果实软化的重要影响因素，是一个高度有组织的过程，涉及各种细胞壁水解酶之间的复杂相互作用[4-5]。本文综述了番茄成熟软化过程中的细胞壁果胶、纤维素或半纤维素、多糖降解相关基因和所编码的水解酶、伸展蛋白及其受上游调控的转录因子之间的主要作用机制，并在此基础上总结了上述影响因素在造成番茄果实软化这一过程中的相互关系。

1 番茄细胞壁果胶相关基因及其所编码的酶

果胶通常由原果胶、水溶性果胶和果胶酸组成。番茄果实成熟过程中，原果胶分解成溶解性果胶,最终降解为半乳糖醛酸,这一过程需要多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase,PG）、果胶甲酯酶（Pectin pectylhydrolase, PME）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase, β-GAL）以及多果胶裂解酶（Pectate lyases, PL）等许多与果胶解聚相关的酶共同参与。

1.1 多聚半乳糖醛酸酶（PG）

多聚半乳糖醛酸酶主要通过作用于1,4-2-D-半乳糖苷键，催化果胶分子裂解生成低聚半乳糖醛酸或半乳糖醛酸，使细胞壁发生解体，从而导致果实变软。早在1988 年，Bird 等[6]就发现编码蛋白区域的序列是一段PG cDNA，并证明了每个基因组只含有一个编码PG 的基因。利用番茄成熟突变体alc、nor 和rin 为研究材料，研究人员发现果实成熟过程中PG 活性很低或不含PG 活性，而突变体材料的果实细胞壁层次清晰可见，胞间层结构紧密、均匀而连续，胞壁纤维排列整齐，这进一步说明PG 可以通过改变细胞壁结构来影响果实软化的过程[7]。近年来在番茄基因组中已经鉴定出54 个PG 基因[8]，本文整合了番茄不同PGs表达相关基因及研究进展（表1），关于不同PG 基因在细胞壁果胶裂解过程中的分子机理仍有待进一步探究。

表1 番茄PGs 相关基因及其表达位置Table 1 PGs related genes and the expression positions in tomatoes

除了基础研究领域，PG 基因也被广泛应用到番茄的生产环节。陈丽萍等[9]采用传统的根瘤农杆菌介导法将PG 反义基因导入加工番茄品种B04中，抑制转基因番茄中内源PG 的活性，解决了番茄在贮存与运输过程中腐烂变质的问题。

1.2 果胶甲酯酶（PME）

果胶甲酯酶通过作用于果胶分子链上半乳糖醛酸羧基上的酯化基团，使内源果胶在原位脱去甲基，果胶水溶度增大，生成便于与PG 作用的底物，进而使番茄果实软化[10-11]。2001 年，Micheli[12]证实了植物体中果胶甲酯酶可以催化细胞壁的PG 去甲基化作用，但是与PG 基因相比，这种去甲基化作用所产生的效果又是极其不明显的[13]。也有研究认为PME 通过激活早期成熟过程中PG 的活性来参与果实软化过程[14]，但其活性与番茄果实硬度及细胞壁组分无显著相关[15]。近年来，研究人员从番茄果皮组织中分离得到两种主要的PME 亚型（PME1 和PME2）并分别成功获得它们的突变体以及双突变体材料。研究表明，PME2 对果胶的去酯化反应有很大影响[16]。与此同时，Reca 等[17]采用功能基因组的方法从番茄中鉴定了一个果胶甲酯酶抑制蛋白并命名为SolyPMEI，可以和PME-1 互相作用来共同调节甲酯化果胶在果实成熟过程中的时空分布。

1.3 β-半乳糖苷酶（β-Gal）

在番茄果实成熟过程中，β-半乳糖苷酶（β-Gal）能够将果胶半乳糖水解为葡萄糖和半乳糖而参与细胞壁代谢[18-19]。番茄果实中存在3 种β-半乳糖苷酶的同工酶，即β-Gal Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，但仅有β-Gal Ⅱ与果实软化相关，可催化β-(l, 4)-半乳糖苷键发生降解。Brummell 等[4]研究发现了半乳糖代谢与果实成熟有一定关系。据报道，番茄基因组中存在17 个β-Gal 基因（表2），所有被检测的β-Gal 酶都具有β-Gal 活性。采用RNAi 技术获得β-Gal4 突变体分析发现β-Gal4 基因参与番茄果实软化过程，但大多数β-Gals 功能仍有待鉴定[20-21]。此外，后续的转基因实验也证实β-半乳糖苷酶基因DKGAL1 在果实成熟过程中可以通过改变番茄果实中半乳糖代谢来减少细胞间的粘附力，促进果实的软化[18]。

表2 番茄TBGs 相关基因及其表达位置Table 2 TBGs related genes and the expression positions in tomatoes

1.4 果胶裂解酶（PL）

果胶裂解酶主要依靠裂解果胶β-1,4-半乳糖醛酸基团从而达到细胞壁解体、细胞分离及果实软化的目的。Yang 等[25]在番茄中鉴定了22 个同源的果胶裂解酶基因，其中SlPL(Solyc03g111690)在果实成熟阶段大量表达。利用RNAi 干扰技术获得了SlPL 沉默株系，SlPL 基因特异性沉默可以有效增强果实的硬度、降低软化速率并延长番茄果实货架期，同时使果实中果胶合成酶、木葡聚糖内糖基转移酶、伸展蛋白等表达量显著降低。

1.5 鼠李糖醛酸裂解酶（RGL）

鼠李糖苷I（RG-I）是植物细胞壁果胶的一个结构域，鼠李糖醛酸裂解酶通过裂解位于主链l-鼠李糖与d-半乳糖醛酸残基之间的α-1,4 糖苷键来降解RG-I。为了研究RGL 在番茄果实软化中的作用，Ochoa-Jiménez 等[26]和Berumen-Varela 等[27]在番茄35S 启动子下表达了solyc11g011300 基因，发现转基因番茄果实表现出更强的硬度、更长的货架期和更少的枯萎量，同时转基因番茄果实的成熟时间延迟了一周。

2 番茄细胞壁纤维素或半纤维素相关基因及其编码的酶

2.1 木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（Xyloglucan endotransglycosylase，XET/XTH）

木葡聚糖是半纤维素多聚糖的重要组分之一，与半纤维素及纤维素微纤丝协同构成网状结构，是细胞壁的主要机械支撑物[28]。Maclachlan 等[29]和Sakurai 等[30]通过比较番茄果实成熟突变体rin 与野生型果实中的木葡聚糖分子量的变化，发现果实的软化可能与半纤维素木葡聚糖的降解有关。木葡聚糖内糖基转移/水解酶（XET/XTH）是木葡聚糖在细胞壁解聚和再连接的关键酶，具有催化木葡聚糖分子水解和糖基转移的双重作用，它在番茄果实成熟软化过程中发挥重要功能。XET 通过水解木葡聚糖β-1-4 糖苷键的主链，将新生成的降解末端转移至其他木葡聚糖多聚体的C 端[31]。同时，细胞壁还能通过XTHs 编码的木葡聚糖水解酶XET 的活性来催化木葡聚糖的水解[32]。Saladié等[33]在番茄中发现了25 个XTHs 基因，本文整合了番茄不同XTHs 相关基因及研究进展（表3）。研究表明，乙烯处理也能激活XET 的活性，尤其是SlXTH5和SlXTH8 能受到乙烯的显著诱导，协同通过影响细胞壁水解的过程来参与对番茄果实成熟的调控[34]，但其具体的分子调节机理仍有待进一步探讨。

表3 番茄不同XTHs 相关基因及其表达位置Table 3 XTHs related genes and the expression positions in tomatoes

2.2 内切-1,4-β-D-葡聚糖酶（Endo-1,4-β-Dglucanase,EG）

EG 是纤维素酶3 种主要组分之一,对木葡聚糖、羧甲基纤维素以及具有葡聚糖结构的物质表现出活性。在番茄中目前一共发现7 个编码EG 的基因。其中随着番茄果实的成熟，LeCel1 和LeCel2 在mRNA水平上逐渐积累，且能够受到外源乙烯的诱导，说明其转录表达可以受到植物激素乙烯的调控[4]。除此之外，研究表明LeCel1 和LeCel2 蛋白易于在番茄叶片中高度积累，并在病原菌抗性方面发挥着重要作用[35]。而在其他物种中，研究还发现EG 活性与白梨果实成熟密切相关，PbEG3 在果实成熟和软化过程中可能发挥着更为重要的作用[36]。

3 番茄细胞壁多糖降解相关基因及其编码的酶

甘露聚糖内切酶是一种多糖降解酶，主要水解甘露聚糖之间的β-1,4 共价键，甘露聚糖酶被认为通过参与细胞壁的降解在番茄果实成熟过程中发挥作用[37-38]。1997 年，Huysamer 等首先发现了番茄果实中存在甘露聚糖，但甘露聚糖在番茄果实细胞壁中比例并不高。随后不久，甘露聚糖酶活性也在番茄果实中被进一步证实，且在番茄品种Trust 中,甘露聚糖酶活性可以随着果实成熟而增加[39]。截至目前,研究人员已经鉴定出番茄果实中的甘露聚糖酶基因并命名为LeMan4 基因[40]。为了进一步探究LeMan4 基因在细胞壁降解和果实软化中所发挥的功能，Wang 等[41]分别构建了GUS 和GFP 转基因株系，发现Leman4a 主要定位在细胞壁，且在果实果皮和外果皮中高度富集。然后利用RNAi 和反义RNA 干扰技术，研究者获得了突变体材料，分析发现突变体果实硬度与野生型材料相比略有降低，因此分析认为，Leman4a 基因确实参与果实成熟过程，但不足以引起细胞壁的水解，推测可能还与其他已知的细胞壁修饰酶起协同作用共同参与细胞壁重排的过程。赫崇慧[42]发现在番茄果肉中甘露聚糖酶与PG、PME 和纤维素酶存在着一定的协同作用关系，并且这种协同关系影响着果肉的成熟软化过程。

4 伸展蛋白（Expansin proteins，Exp）

伸展蛋白通过打断细胞壁纤维素和半纤维素之间的共价键，使它们之间发生位移，最终引起细胞壁松弛[43]。双子叶植物的Exp 是一个小分子蛋白，由25个基因构成的基因家族编码。Brummell 等[44-45]认为在番茄中，扩展基因LeExp1 诱导果实成熟相关基因的mRNA 和蛋白质积累，LeExp1 突变体果实在整个成熟过程中明显比对照更坚硬。此外，研究发现SlExp1的碳水化合物结合基序（Carbohydrate binding module,CBM）对植株和果实表型都有影响，SlExp1-CBM 转基因植株表现出延迟软化和结实的表型[46]。大多数情况下，Exp 蛋白被认为可以影响番茄果实成熟早期引起的细胞壁变化的某些酶的活性变化，特别是木葡聚糖内糖基转移/水解酶和β-半乳糖苷酶的活性等[19]。例如Minoia 等[47]发现番茄突变体中SlExp1 基因功能的缺失可以通过影响XET/XTH 活性来改变纤维素的结构，最终延缓果实的衰老。进一步对SlExp1-7 突变体植株的细胞壁组分分析，发现木葡聚糖结构发生了较大的变化。

5 转录因子

随着分子生物学技术的不断发展，一些调控细胞壁水解的转录因子也陆续被发现。GRAS 家族蛋白是植物所特有的转录因子，Zhang 等[48]进一步研究发现一种新的GRAS 基因，命名为SlFSR (Fruit shelf-life regulator)。在果实成熟过程中SlFSR 的表达显著增加，但在番茄成熟突变体rin 中显著降低。同时SlFSR的表达受到外源乙烯的诱导，推测SlFSR 基因可能位于乙烯信号的下游发挥作用。RNAi 抑制SlFSR 基因后导致多个细胞壁修饰相关基因表达量减少，PG、TBG 和CEL 活性明显降低，果实货架期显著延长。此外，rin 中SlFSR 基因过表达导致PG、TBG4、CEL2、PL、PME、MAN1、EXP1 和XTH5 等多个细胞壁修饰相关基因的表达上调，显著缩短了果实的货架期，表明SlFSR 基因是控制番茄果实货架期的另一个潜在的生物技术靶点。

目前在番茄中共发现101 个不同的NAC 转录因子，其中SlNAC1 和SlNAC4 被证明可以参与调控番茄果实成熟的过程。SlNAC1 转录因子能与乙烯合成基因PSY1、ACS2、ACO1 的启动子特异性结合，通过在转录水平上调控番茄乙烯的生物合成过程，进而影响果实软化[49]。相反，在SlNAC1-RNAi 转基因株系中，果实软化过程受到明显抑制并且伴随着乙烯生物合成相关基因的大量诱导[50]。同样，利用RNAi 技术沉默SlNAC4 的表达后，番茄果实成熟滞后，体内乙烯含量也急剧减少，说明SlNAC4 也可以通过乙烯合成的途径来调控番茄果实软化的过程[51]。此外，最近一个新型的NAC 转录因子NOR-like1 也被发现可以参与番茄果实的调节过程。RNA 测序结果显示NOR-like1 不仅能够影响乙烯的生物学合成（SlACS2,SlACS4），还能够通过改变细胞壁代谢相关酶PG、PL、CEL2、EXP1 的活性来参与番茄成熟的过程[52]。RIN 转录因子是MADS-box 家族成员之一，主要控制番茄果实成熟。近年来通过蛋白质组学、电泳迁移率分析（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等分析手段鉴定了一系列新的RIN 靶基因。研究表明，LeACO4 和α-Gal 基因的启动子区域检测到RIN 蛋白特定结合位点CArG 基序，表明RIN 可能直接调控它们的转录，这些结果进一步证明了RIN 在番茄果实成熟软化尤其是在细胞壁降解过程中所发挥的作用[53]。

6 小结与展望

在番茄果实成熟软化中，多种细胞壁相关基因、酶和转录因子共同起作用，王倩等[54]研究了不同耐贮性的番茄品种，发现随着贮藏时间的延长，与普通的“津粉207”番茄品种相比，耐贮性强的“欧盾”品种多聚半乳糖酶、果胶酯酶、β-半乳糖苷酶和纤维素酶等相关酶活性明显偏低，乙烯释放量低，番茄果实硬度下降较慢。该结果进一步验证了乙烯与细胞壁水解酶相互交织，共同影响番茄正常的果实衰老过程。综上结论，本文绘制了番茄果实成熟过程中几种常见转录因子通过调节乙烯合成途径，最终影响细胞壁代谢的调控网络（图1）。

图1 转录因子、乙烯和细胞壁水解酶调控果实成熟软化机制Fig.1 Regulatory mechanism of transcription factors,ethylene and cell wall hydrolase in tomato fruit softening

从图1 可以看出，乙烯（Ethylene）的合成影响番茄果实软化，两个主要酶ACO（ACC 氧化酶）和ACS（ACC 合成酶）影响着乙烯的合成，转录因子MYBs和NACs 影响ACO 的活性，转录因子NOR-like1 通过影响ACS 的活性而影响ACO 的活性。乙烯通过影响转录因子SIFSR 而进一步激活细胞壁中PG、PL、PME、EXP1、MAN4 和TBG4 等酶的活性，从而影响细胞壁的代谢，最终影响果实软化。

近年来随着基因编辑手段在水稻、拟南芥等模式作物中的大规模应用，番茄遗传材料的获得也越来越便捷有效。然而，目前针对细胞壁水解酶的研究仍多集中在单个水解酶或者某一类水解酶家族在番茄果实成熟中所起的作用，细胞壁水解酶之间存在的相互关联，植物激素以及转录因子之间的调控网络有待进一步完善。此外，目前影响番茄果实成熟的细胞壁水解酶相关基因的研究仍集中在同源基因功能的验证，采用正向遗传学的方法挖掘细胞壁水解过程中的新基因也应该是科研工作者们关注的重点内容。与此同时，针对不同番茄品种、不同种植地域、同一番茄品种的不同生育期，控制其果实软化的关键水解酶也不尽相同，因此在农业生产应用上还需注意因时因地制宜，其更深层次的调控机理还需进一步研究。