反复着床失败患者预防性免疫治疗后妊娠结局评估①

赵 捷 李小雪 葛逸盟 马彩红 李 蓉

（北京大学第三医院妇产科生殖中心，北京 100191）

全球约1.86 亿人口和8%～12%的育龄夫妇患有不孕不育，尽管体外受精-胚胎移植技术（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）成为治疗不孕症的有效手段，但仍有8%～10%的患者经历着反复着床失败（repeated implantation failure，RIF）而未能成功妊娠［1］。目前RIF 尚无统一的诊断标准，广泛认同的定义是：年龄＜40 岁的女性，至少经过3 次新鲜或者冻融胚胎移植周期，累计至少移植4 枚优质胚胎而未能获得临床妊娠为RIF［2］。

作为生殖领域的难点，RIF 患者病因不明，难以查找，因此无有效的处理手段。目前认为50%～60%的RIF 可能与子宫内膜局部免疫相关，但临床常用相关抗体检查只能筛出合并有自身免疫性疾病的患者进行免疫治疗，而对于非合并自身免疫疾病患者的治疗，则不能提供治疗依据［3］。虽然目前国内外尚无相关指南或共识，尝试性应用阿司匹林或免疫抑制剂已广泛应用于临床RIF 患者的治疗，有研究认为预防性口服阿司匹林或者联合应用强的松可作为有效的治疗手段，但另有研究得出不一致的结果［4-8］，为了解目前临床常用抗体检查与预防性治疗之间的关系，本课题组进行了该回顾性研究。

1 资料与方法

1.1 资料 回顾性分析2016年1月至2017年12月在北京大学第三医院生殖医学中心因RIF行解冻移植的患者临床资料，所有患者信息来源于患者病历、医院信息中心与生殖中心数据库。该回顾性研究经本院伦理委员会批准，免除研究对象知情同意。

2016年1月至2017年12月期间共有1 078例患者诊断为RIF，即年龄＜40 岁至少经过3 次新鲜或者冻融胚胎移植周期，累计至少移植4 枚优质胚胎而未能获得临床妊娠者。所有患者都曾进行过抗核抗体谱、抗心磷脂抗体检查、狼疮抗凝物、抗凝血酶、蛋白S、蛋白C、血小板聚集率等相关检查，排除合并有系统性红斑狼疮患者1 例，抗磷脂综合征2 例，类风湿关节炎4 例，干燥综合征3 例，未分化结缔组织病患者6例，剩余1 062例RIF患者。

1 062 例患者中排除卵巢功能减退者48 例，即IVF 前检查抗苗勒氏管激素（anti-mullerianbormone，AMH）≤1.1 μg/L［9］；排除合并子宫肌瘤者65 例，合并卵巢囊肿者32例，子宫完全或者不全纵隔者8例，单角子宫或双子宫共5 例，排除有子宫黏连史移植前内膜厚度≤7 mm 患者5 例，2 次移植前内膜厚度≤7 mm患者12例，子宫腺肌症或腺肌瘤患者43例，子宫内膜异位症12 例，排除有血栓史患者3 例，原发性血小板增多症1 例，排除以上疾病后，剩余患者828例。

1.2 方法

1.2.1 分组及观察指标 将1.1 中828 例患者，根据移植前是否曾用药分为2 组，治疗组为移植前开始用阿司匹林+强的松至少14 d者共450例患者，对照组为未用药者共378 例患者。亚组分类：两组患者中，将抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）比值为1∶80 者的患者筛选出来，其中ANA 1∶80 对照亚组72例和ANA 1∶80治疗亚组106例，共178例。

此外，针对低补体C3、低补体C4、高免疫球蛋白A、高免疫球蛋白G、高免疫球蛋白E，从828 例两组患者中，将单个指标符合以上检查结果的患者筛选出来，共124 例，分别为个别抗体异常对照亚组56例和个别抗体异常治疗亚组68例。

比较两组间及各个对照亚组与治疗亚组间移植后临床妊娠率、胚胎着床率、早期流产率和持续妊娠率。

1.2.2 用药方法及助孕情况 治疗组患者阿司匹林应用：移植前后至少口服14 d，每日口服75～100 mg；强的松应用：移植前后至少口服14 d，每日5 mg。

所有患者均行解冻胚胎移植，移植方案有自然周期解冻移植和人工周期解冻移植两种。自然周期解冻移植适用于月经周期规律、能正常排卵者，B超监测卵泡生长和排卵情况，排卵后第3 天解冻移植卵裂期胚胎或排卵后第5天移植囊胚期胚胎。人工周期适用于月经周期不规律、长期持续无排卵或子宫内膜生长不良者，于月经周期第2～3 天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国先灵公司）4～6 mg/d，根据内膜厚度调整剂量，内膜厚度达到8 mm 以上时给予黄体酮转化内膜，4 d后解冻移植卵裂期胚胎或6 d 后解冻移植囊胚。囊胚率为移植囊胚数比胚胎总数［10］。

1.2.3 妊娠判断及监测 观察指标包括：主要结局：临床妊娠率，临床妊娠率=临床妊娠周期/移植周期，临床妊娠指胚胎移植后28～30 d 超声探及宫内妊娠囊或临床明确诊断异位妊娠者；次要结局：包括①早期流产率，早期流产率=早期流产周期/临床妊娠周期，早期流产指妊娠12 周前的胎儿丢失；②持续妊娠率，持续妊娠率=持续妊娠周期/移植周期，持续妊娠为宫内妊娠活胎持续至妊娠10 周者；③胚胎着床率，胚胎着床率=有心管搏动的孕囊数/移植胚胎总数；监测：移植后第14 天与21 天抽血查β-HCG，移植后第30天与第37天做盆腔彩超检查。

1.3 统计学方法 使用SPSS25.0软件进行数据处理和统计分析。对于符合正态分布的计量数据采用表示，采用独立样本t检验进行组间比较。计数资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 精确概率法进行，Logistic 多元逐步回归分析影响临床妊娠率的因素。所有检验以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 828例患者对照组与治疗组间比较

2.1.1 828 例患者对照组与治疗组间一般资料比较 828 例患者中，对照组与阿司匹林+强的松治疗组患者在年龄、体重指数（body mass index，BMI）、不孕年限、抗缪勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）、基础促卵泡生成素（follicle stimulatin hormone，FSH）和既往移植次数的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在解冻移植周期时的转化内膜厚度、移植胚胎数、囊胚率和自然周期率的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.1.2 828 例患者对照组与治疗组两组间妊娠结局比较 治疗组患者在此次解冻周期中的胚胎着床率与临床妊娠率分别为36.12%与40.89%，数值上略高于对照组的33.91%与39.68%；早期流产率为17.39%，略低于对照组的18.00%，但差异均无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 828例患者对照组与治疗组两组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

表1 828例患者对照组与治疗组两组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.1 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 828 patients in two groups（）

根据移植胚胎的阶段，分为卵裂期胚胎和囊胚期胚胎移植两亚组。卵裂期胚胎移植亚组里，治疗组胚胎着床率、临床妊娠率和持续妊娠率分别为27.45%、35.29%和26.14%，数值上略高于对照组的25.93%、33.33% 和24.44%，早期流产率为25.92%，低于对照组的26.67%，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。同样地，在囊胚期胚胎移植亚组内，治疗组胚胎着床率、临床妊娠率和持续妊娠率分别为44.88%、43.77%和37.37%，稍高于对照组的42.60%、43.21%和37.04%，早期流产率治疗组为14.61%，对照组为14.29%，但两组间差异均无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 828例患者两组卵裂期胚胎与囊胚期胚胎解冻移植妊娠结局比较Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of 828 patients in two groups

进一步就年龄、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前内膜厚度和移植胚胎数与临床妊娠率之间进行多元回归分析，发现均无相关性（表3）。

表3 临床妊娠率影响因素多元回归分析Tab.3 Multiple regression analysis of risk factors in clinical pregnancy rate

2.2 178 例ANA 抗体1∶80 患者治疗组与对照组间比较 ANA 1∶80患者对照组与治疗组的比较，两组在年龄、BMI、不孕年限、AMH、基础FSH、转化内膜厚度、囊胚率和移植胚胎数等一般情况的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；在该解冻移植周期中治疗组的胚胎着床率、临床妊娠率、持续妊娠率数值均略高于对照组，但与早期流产率一样，两组间差异均无统计学意义（P＞0.05，表4）。

表4 ANA 1∶80 对照组与治疗组两组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

表4 ANA 1∶80 对照组与治疗组两组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.4 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of ANA 1∶80 patients in two groups（）

同样地，根据移植胚胎的阶段，将两组分为卵裂期胚胎和囊胚期胚胎两亚组。两个亚组中治疗组的胚胎着床率、持续妊娠率、临床妊娠率数值上都稍高于对照组，早期流产率都低于对照组，囊胚期胚胎移植亚组中治疗组的早期流产率数值为13.79%，低于对照组的15.79%，但差异无统计学意义（P＞0.05，表5）。进一步就年龄、BMI、不孕年限、AMH、FSH、移植前内膜厚度和移植胚胎数与临床妊娠率之间进行多元回归分析，发现均无相关性。

表5 ANA 1∶80患者两组卵裂期胚胎与囊胚期胚胎解冻移植妊娠结局比较Tab.5 Comparison of pregnancy outcomes after thawing cleavage embryo/blastocyst transfer of ANA 1∶80 patients in two groups

2.3 124例1个指标异常患者治疗组与对照组间比较 两组间在低补体C3率、低补体C4率、高免疫球蛋白A 率、高免疫球蛋白E 率和高免疫球蛋白G 率、年龄、BMI、不孕年限、AMH、基础FSH等一般情况的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，表6）；在该解冻移植周期时的转化内膜厚度、囊胚率、移植胚胎数和胚胎着床率、临床妊娠率、持续妊娠率和早期流产率等的差异均无统计学意义（P＞0.05，表6），无论是在卵裂期胚胎亚组内，还是囊胚期胚胎亚组内，治疗组的胚胎着床率、临床妊娠率和持续妊娠率数值上都稍高于对照组，早期流产率略低于对照组，差异均无统计学意义（P＞0.05，表7）。

表6 124例个别抗体阳性患者对照与治疗组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表6 124例个别抗体阳性患者对照与治疗组一般临床资料和解冻移植情况比较（）Tab.6 Comparison of characteristics and pregnancy outcomes of 124 patients with one abnormal antibodies in two groups（）

表7 124例个别抗体阳性患者两组卵裂期胚胎与囊胚期胚胎解冻移植妊娠结局比较Tab.7 Comparison of pregnancy outcomes after frozen thawed embryo transfer in 124 cases of individual antibodies positive normal antibodies in two groups

3 讨论

胚胎的侵入是一个生理性的炎症过程，是胚胎与子宫内膜间免疫微环境破坏重建并维持平衡的过程，局部免疫功能紊乱可以降低子宫内膜容受性，导致RIF［11-13］。尽管机制尚未明了，甾体激素、羟氯喹、强的松、他克莫司、淋巴细胞主动免疫、聚落刺激因子、被动免疫治疗如静脉注射免疫球蛋白等已经尝试性应用于临床，其中强的松因相对安全、方便价廉，与阿司匹林联合应用最多，但是疗效未得到证实［14-17］。一项随机对照研究对既往1～2 周期ICSI失败的195 例患者给予强的松+阿司匹林治疗，认为治疗后可利于提高胚胎种植率［18］；另外一项前瞻性研究认为，对于抗卵巢抗体阳性的既往两周期IVF 失败的患者，强的松应用可以提高着床率与妊娠率［19］；然而，另有回顾性研究发现，对既往≥2 周期IVF 失败的患者，强的松+阿司匹林的临床应用不能改善患者最终妊娠结局［20］。本研究回顾性分析也得出类似的结果，虽然数值上胚胎着床率、临床妊娠率、持续妊娠率略有提高，早期流产率略有下降，但是无显著性差异。

育龄期间常见的自身免疫系统疾病包括系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿关节炎、桥本甲状腺炎、结缔组织病和抗磷脂抗体综合症，其中抗磷脂抗体综合症是最影响妊娠结局和最容易导致妊娠不良结局发生的自身免疫性疾病，免疫抑制剂、阿司匹林与肝素治疗可以明显改善生殖结局和妊娠结局［21-22］。RIF 患者中仅有4.3%～8.0%的患者被发现患有上述自身免疫性疾病可以进行相应治疗，而70%～85%患者就目前常见免疫学相关检查不能发现异常或者仅个别指标异常而不能诊断为自身免疫性疾病［23］。在常见的免疫抗体检查中，ANA 是一组对细胞核内的DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合物产生的自身抗体，是最常见的阳性指标，常见于各种自身免疫疾病，在健康人群中单纯阳性率为13.45%，一般认为可以不需治疗，定期风湿免疫科随访即可［24］，而RIF 人群中外周血ANA 阳性率可增高达15%～20%，认为在内膜局部或者卵泡液中阳性可能导致细胞的异常凋亡而影响着床，但是缺乏系统基础研究和较少的临床研究，目前认为ANA 1∶80 不需要治疗，定期复查与随访观察［25］；FAN 等［26］的研究选择了133 例ANA 阳性≥1∶160 的IVF-ET 患者，其中60 例在IVF-ET 之前3 个月开始口服强的松10 mg/d+阿司匹林100 mg/d，同时比较73例未用药的患者，发现ANA阳性患者进行治疗后可以明显增加着床率，减少早期流产率，但是该研究没有将ANA 1∶80 的患者纳入研究范围。本研究回顾性分析首次将ANA 为1∶80 的临界患者作为观察对象，发现ANA 阳性患者经阿司匹林+强的松数值上可以提高着床率与临床妊娠率数值，降低早期流产率，但是与未治疗组比较无显著性差异。

在临床常用RIF 免疫学检查中，补体系统是体内重要的免疫效应系统和放大系统，参与免疫调节与抗感染，补体C3、C4 是补体系统中含量最高的成分，在生殖领域中补体系统参与了早期的精卵结合，近年在卵巢组织中测序到补体的存在，认为补体参与了卵巢局部组织的重建［27］。此外，免疫球蛋白是血液和组织液中的一类糖蛋白，由B 淋巴细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，能与相应抗原特异性结合，是介导体液免疫的重要效应分子，然而，补体系统与免疫球蛋白在子宫内膜局部免疫微环境及在着床过程中的作用尚不清楚，亦未见与RIF患者的相关研究［28］。本研究回顾性分析将补体C3、补体C4、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白E抗体检查中单个指标异常的患者筛选出来，发现阿司匹林+强的松后可以提高胚胎着床率、临床妊娠率和持续妊娠率的数值，降低早期流产率，但是与未治疗组相比无显著统计学差异。

目前针对有自身免疫性疾病拟辅助生育的患者，已经形成共识，认为通过风湿免疫科规律有效的免疫治疗后可以改善生殖结局。然而，针对无明确自身免疫性疾病的RIF 患者或者反复流产的患者，在生殖领域进行免疫疗法以改善生殖结局是有争议的，部分研究认为可以提高胚胎着床率、降低早期流产率，但多项前瞻性研究认为免疫疗法并不能提高IVF-ET患者活产率，建议免疫疗法应用于研究，或者更准确地筛选出适宜干预的患者，而不应用于常规临床实践以改善生殖结果［5，11］。

综上所述，该研究结果提示对于不具有自身免疫性疾病的RIF患者，阿司匹林+强的松的治疗不能显著改善生殖结局，而针对ANA 1∶80 的患者、单独一个低补体C3/C4 或者单独高免疫球蛋白的患者，阿司匹林+强的松的治疗也不能显著提高胚胎着床率、临床妊娠率和持续妊娠率，降低早期流产率。然而，鉴于该研究样本量小，为回顾性研究，存在回顾性研究的局限性和临床样本少的缺陷，不能完全客观准确评估，因此关于强的松或其他免疫抑制剂的临床应用，需要扩大样本量和开展大规模的多中心前瞻性研究，并进行相关的基础研究，可以更准确地筛选患者和提高RIF 患者的治疗效果，同时为RIF患者的治疗提供理论依据。