应用不平衡法检测赣南地区原发性肺腺癌ALK融合突变

钟炜祥，韦晰凤

0 引言

肺癌是目前我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，作为非小细胞肺癌（NSCLC）继表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变之后被发现的第二大突变基因—棘皮动物微管相关蛋白4-间变淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）融合基因在NSCLC发生、发展、预后及转归中扮演着重要角色，尤其是肺腺癌最具有特点的致癌基因。文献[1-4]报道不同地区的NSCLC患者中EML4-ALK融合突变存在差异，目前赣南地区尚无ALK融合基因的相关报道。本研究通过不平衡法（即基于3'端和5'端的表达水平不平衡策略的qRT-PCR方法）检测赣南地区原发性肺腺癌组织中ALK融合基因的表达情况，回顾性分析其临床病理特征，旨在探讨赣南地区原发性肺腺癌ALK融合基因的特点，科学指导此类患者优选靶向用药。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取赣南医学院第一附属医院2016年—2020年经病理检查确诊为原发性肺腺癌的病例233例，其中男127例（54.51%），女106例（45.49%），平均年龄（60.3±10.618）岁，中位年龄61岁（34～89岁）；无吸烟史142例（60.94%），有吸烟史91例（39.06%）；临床分期按国际肺癌研究协会第八版国际肺癌TNM分期标准执行：Ⅰ期42例（18.02%）、Ⅱ期17例（7.30%）、Ⅲ期21例（9.01%）、Ⅳ期153例（65.67%）。入组患者分布于赣南地区，均为初治，未接受过化疗、放疗或靶向治疗。

1.2 方法

1.2.1 筛选病例 经外科手术切除或CT引导下经皮肺穿刺活检或电子支气管镜活检组织标本233例，其中石蜡切片组织标本201例，新鲜活检组织标本32例。经赣南医学院第一附属医院科学研究伦理委员会审查批准（编号：LLSC-2021081601）。

1.2.2 标本固定 由医院病理科进行石蜡包埋固定，按至少5 μm厚度切取病理白片15张外送。32例新鲜组织标本离体后储存在RNAfixer组织保存液中固定后外送。经患者知情同意后，233例样本先后外送至浙江鼎晶医学检验所进行ALK融合基因检测。

1.2.3 总RNA提取 采用组织RNA抽提kit（Qiagen）试剂盒提取样本总RNA，紫外分光光度仪测定模板总RNA的浓度（＞30 ng/μl）和纯度（OD260/OD280值为1.8～2.0）。

1.2.4 反转录（reverse transcription,RT）合成cDNA 参照M-MLV反转录试剂盒说明书设置RT程序：25℃ 5 min；42℃ 60 min；75℃ 5 min；4℃ 5 min。

1.2.5 Real-time PCR体系 RT产物通过SYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems）试剂进行PCR反应，反应体系中加入荧光物质并采用ABI 7500 PCR仪检测。PCR程序参照人EML4-ALK融合基因检测试剂盒（real time PCR）使用说明书进行设置：（1）UNG酶反应：50℃ 2 min 1个循环；（2）预变性：95℃ 10 min 1个循环；（3）变性：95℃ 15 s；退火、延伸及检测荧光（荧光通道为FAM）60°C 32 s，共45个循环；（4）溶解曲线（60℃～95℃按1%的速度递增，此阶段吸收荧光信号）：95℃ 15 s 1个循环；60℃ 1 min 1个循环；95℃ 30 s 1个循环；60℃ 15 s 1个循环。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

1.3 统计学方法

本组资料为计数资料，以百分数表示。应用SPSS24.0软件，采用χ2检验或确切概率法进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALK融合基因的表达情况

入组233例样本，共检测出21例ALK基因融合，表达率为9.01%，见图1。

图1 ALK融合突变Real-time PCR图Figure 1 Real-time PCR pictures of ALK fusion mutation

2.2 ALK融合突变与肺癌患者临床病理特征的关系

女性、N1-3患者ALK融合基因表达率为13.2%（14/106）、12.5%（18/144），均显著高于男性（5.5%）、N0（3.4%）患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；ALK融合基因在新鲜组织标本、年龄＜55岁、无吸烟史以及M1期患者中的表达率相对较高，但未达统计学意义（P＞0.05）；ALK融合基因的表达与TNM分期、T分期、是否手术治疗以及肿瘤分布位置均无相关性（P＞0.05），见表2。

表2 赣南地区肺腺癌患者ALK基因融合与临床病理特征的关系Table 2 Relation between ALK fusion and clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma in Gannan region

2.3 ALK融合突变与肺癌常见部位转移的关系

在153例M1期病例中，肺癌常见转移部位按发生率大小依次是骨转移、脑转移、对侧肺转移、胸膜播散（恶性胸水、心包积液或胸膜结节）/肾上腺转移以及肝转移，亚组分析均未发现ALK融合突变与肺癌常见部位转移的相关性（均P＞0.05），见表3。

表3 赣南地区153例M1期肺腺癌患者ALK基因融合与肺癌常见部位转移的关系Table 3 Relation between ALK fusion and metastasis of common sites of lung cancer in 153 M1-stage patients with lung adenocarcinoma in Gannan region

3 讨论

目前肺癌的诊疗已迈入了精准医学时代，EML4-ALK是继EGFR之后第二受关注的基因，也是NSCLC中最常见的ALK融合基因，亦是在NSCLC中第一个发现的融合基因激酶抑制靶点。在EML4-ALK融合基因中，EML4的N端与ALK胞内的络氨酸激酶区发生融合，导致ALK融合基因异常表达，此外融合伴侣EML4可促进融合蛋白的二聚和低聚反应，导致ALK酪氨酸激酶区及下游PI3K/AKT及MAPK等信号通路激活，从而引起细胞异常增殖和分化[5]。在NSCLC中被发现的ALK融合基因还包括KIF5B-ALK、TFG-ALK、KLC1-ALK等[6-7]。近年来，针对ALK融合基因的靶向治疗药物发展迅速，克唑替尼[8]、阿来替尼[9]、劳拉替尼[10]等ALK-TKIs的临床使用显著改善了ALK阳性晚期NSCLC患者的生存，对ALK融合突变 NSCLC具有类似于EGFR-TKIs的疗效，ALK-TKIs通过竞争性结合于ALK激酶区，阻断ALK下游的信号转导通路，从而达到治疗效果。

本研究入组病例来自赣南地区十八县市区，以客家人居多，ALK融合基因的表达率为9.01%（21/233），高于ALK融合基因的整体表达水平（3%～7%）[11]，提示ALK融合突变可能存在一定的区域或人种差异。回顾性分析发现，女性患者ALK融合基因的表达率明显高于男性患者（P＜0.05），与王惠宇等[12]研究结果类似，Ke等[13]研究亦表明ALK融合基因更多见于女性。ALK融合突变的性别差异可能与雌激素相关，有研究[14]表明雌激素受体表达增加可能与性别相关的NSCLC发生风险增加有关。同时，有淋巴结转移（即N1-3）患者ALK融合基因的表达率显著高于无淋巴结转移（即N0）患者，Tian等[15]回顾性研究亦表明ALK融合突变肺腺癌患者可能有淋巴结转移倾向。

既往研究[16-18]表明ALK融合突变多见于年轻NSCLC患者，且ALK融合突变阳性患者的年龄较阴性患者小4～5岁[19-20]。本研究选取55岁作为年龄界定点进行统计分析，未发现ALK融合突变在不同年龄组间的显著差异（P＞0.05）。

吸烟作为肺癌最密切的致病因素，Sasaki等[21]报道非吸烟NSCLC患者具有更高的ALK融合突变风险。本研究结果显示，ALK融合基因在无吸烟史患者中的表达率相对较高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

目前，手术大标本和新鲜活检组织标本是肺癌基因检测的理想标本，肿瘤细胞含量较多，检出率更高，结果更为可靠[22]。本研究比较了新鲜活检组织和石蜡切片组织标本中的ALK融合基因表达水平，前者相对较高，但差异无统计学意义（P＞0.05），可能与入组病例中新鲜活检组织样本量比例低有关。此外，赣南地区原发性肺腺癌中ALK融合基因的表达与临床分期、T分期、M分期、是否手术治疗以及肿瘤分布位置均无相关性，可能与入组病例的筛选、检测方法的选择以及地域、种族差异等因素有关。

ALK融合突变一般与肿瘤的恶性程度相关，且更易发生淋巴结转移、胸膜转移及脑转移[23]，ALK融合突变患者的预后相对更差。本研究亚组分析未发现ALK融合突变与肺癌常见部位（骨、脑、对侧肺、胸膜播散、肾上腺及肝）转移的相关性（P＞0.05），可能是由样本量的差异、回顾性研究的偏倚等因素造成的。

本实验采用基于3'端和5'端的表达水平不平衡策略的qRT-PCR方法[24]检测肿瘤组织中ALK基因在3'端和5'端的表达差异，分析二者之间的不平衡现象，进而明确是否存在ALK融合基因。只要存在ALK融合基因，即无论是已知的ALK融合基因，还是新的ALK融合基因，不平衡法就可以检测到，而且与肿瘤靶基因高通量测序、FISH等比较，其检测时间更短，对仪器设备和人员要求更低，值得在临床中广泛应用并积极推广。

综上所述，赣南地区原发性肺腺癌患者ALK融合基因的表达率相对较高，好发于女性、有淋巴结转移患者。明确赣南地区原发性肺腺癌患者ALK融合基因的临床特点，科学指导赣南地区NSCLC患者个体化治疗，为此类患者优选靶向用药提供理论依据，进而建立赣南地区肺癌靶向治疗模式并推广应用于临床。

（致谢：感谢鼎晶医学检验所为本研究提供实验部分的支持与帮助！）