金属依赖型厌氧甲烷氧化研究进展

李侠，兰建英 ，蒋海明 *

1. 内蒙古科技大学矿业研究院，内蒙古 包头 0140101；2. 内蒙古科技大学生命科学与技术学院，内蒙古 包头 014010；3. 内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室，内蒙古 包头 014010

甲烷（CH4）是一种温室气体，其温室效应是二氧化碳的26倍（Caldwell et al.，2008）。减少甲烷排放，可以保护大气环境。据Reeburgh（1976）分析，大气中的甲烷约80%来自厌氧条件下微生物降解有机物产生。控制大气中甲烷浓度对控制全球变暖有重要意义。在厌氧环境中，当甲烷作为唯一的电子供体、且存在 SO42-、NO3-、Mn(Ⅳ)及 Fe(Ⅲ)等电子受体时，厌氧甲烷营养古菌（Anaerobic Methanotrophic Archaea，ANME）可以将甲烷氧化为二氧化碳（张梦竹等，2012）。微生物介导的甲烷厌氧氧化（Anaerobic Oxidation of Methane，AOM）是减少自然环境中甲烷排放的重要途径之一（吴忆宁，2019；张梦竹等，2012）。尽管近些年在厌氧甲烷营养古菌、厌氧甲烷氧化机制乃至厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递等方面的研究取得了很大进展，但厌氧甲烷氧化研究仍有许多悬而未决的问题。对不同生态环境中AOM过程和机理进行深入了解和研究，有助于进一步理解生物矿化、全球碳循环及 AOM，并对控制甲烷排放具有十分重要的指导意义（吴忆宁，2019）。

金属氧化物或金属离子可以作为厌氧甲烷氧化的电子受体，且金属依赖的厌氧甲烷氧化是减少全球甲烷排放的一个重要途径。金属依赖的厌氧甲烷氧化研究是生物地球化学、地质微生物学等许多基础学科的研究热点。本文从金属依赖型厌氧甲烷氧化菌、金属依赖型厌氧甲烷氧化机制及金属依赖型厌氧甲烷氧化时胞外电子传递机制对金属依赖型厌氧甲烷氧化研究现状进行了概述，分析了金属依赖型厌氧甲烷氧化研究存在的问题，并讨论了其今后的研究方向，为金属依赖型厌氧甲烷氧化研究提供参考。

1 金属依赖型厌氧甲烷营养古菌研究

AOM 是减少甲烷排放的重要途径之一，包括硫酸盐依赖型厌氧甲烷氧化（Sulfate-dependent anaerobic oxidation of methane，S-DAOM）、硝酸盐/亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化（Nitrate/nitritedependent anaerobic oxidation of methane，NDAOM）及金属离子依赖型厌氧甲烷氧化（Metal ion-dependent anaerobic oxidation of methane，MDAOM）（Cui et al.，2015）（图1）。

图1 3种不同甲烷厌氧氧化模型（Cui et al.，2015）Fig. 1 Three different models of anaerobic oxidation of methane(AOM) depending on the different electron acceptors(Cui et al., 2015)

铁(Ⅲ)/锰(Ⅳ)氧化物在地球表面分布广泛，且含量高。因此，金属依赖型厌氧甲烷氧化对全球碳元素、硫元素、磷元素以及金属元素的循环有着重要影响。2009年，Beal et al.（2009）首次在海洋沉积物中发现 ANME可以在氧化甲烷时耦合金属离子还原，这一现象的发现开辟了金属依赖型厌氧甲烷氧化研究。随后研究者通过化学元素分析法和同位素示踪法证实在海洋冷泉区（Beal et al.，2009；Peng et al.，2017；Sivan et al.，2014a；Wu et al.，2020）、海洋沉积物（Sivan et al.，2007；Riedinger et al.，2014；Treude et al.，2014；Oni et al.，2015；Scheller et al.，2016；Liu et al.，2018；Winkel et al.，2018；Xie et al.，2019；Aromokeye et al.，2020；Roland et al.，2021；陈颖，2014）、咸水沿岸沉积物（Sivan et al.，2011；Egger et al.，2015；Egger et al.，2016；Rooze et al.，2016）、湖泊底泥（Crowe et al.，2011；Sivan et al.，2011；Norði et al.，2013；Torres et al.，2014；Ettwig et al.，2016；Bar-Or et al.，2017；Su et al.，2020）、咸水湿地沉积物（Segarra et al.，2013）、淡水湿地沉积物（Segarra et al.，2013；Zou et al.，2018；Leu et al.，2020；Shi et al.，2020；李玉芳，2016；张乃方等，2018）、河口区（王维奇，2014）及原油污染区（Amos et al.，2012）等都存在金属依赖型厌氧甲烷氧化。在厌氧环境中，金属依赖型厌氧甲烷氧化是一个普遍的过程。在淡水环境中，由于硫酸盐含量低，铁依赖型AOM成为减少甲烷的主要过程（Sivan et al.，2011）。虽然许多文献报道了自然界中存在M-DAOM现象，但在实验室利用富集培养物和纯培养物以实现 MDAOM的报道并不多。Chang et al.（2012）在研究台湾东部泥火山的孔隙水中M-DAOM时，发现包括 ANME-1、ANME-2及 ANME-3在内的几乎所有 ANME的亚类都可参与 M-DAOM。Scheller et al.（2016）的研究显示深海沉积物中的 ANME-2a和 ANME-2c在人工氧化剂可溶性柠檬酸铁和EDTA铁存在下具有氧化甲烷的能力。Ettwig et al.（2016）从荷兰的特文特运河沉积物中富集获得的与厌氧甲烷氧化古菌相关的高纯培养物（AOM-associated archaea，AAA）（认为是ANME-2 d）可在厌氧氧化甲烷的同时还原可溶解性Fe(Ⅲ)、水铁矿、Fe(Ⅲ)与 Mn(Ⅳ)矿物。另一项研究表明，与“Methanoperedens nitroreducens”有关的厌氧甲烷营养古菌在富含铁沉积物的培养过程中参与 AOM（Weber et al.，2017）。但是上述研究都基于混合培养物，并没有得到纯培养物。从ANME-1沉积物中分离得到的纯培养物 Methanosarcina acetivorans C2A能够依靠 Fe(Ⅲ)的还原进行厌氧甲烷营养生长，可以在厌氧氧化甲烷与偶联还原Fe(Ⅲ)的同时产生乙酸，但是其不能在Fe(Ⅲ)介导下将甲烷完全氧化为 CO2（Soo et al.，2016；Yan et al.，2018）。Cai et al.（2018）以澳大利亚昆士兰州金溪水库采集的沉积物样品作为接种物、氢氧化铁为电子受体及甲烷为电子供体，在实验室规模的生物反应器中富集获得了厌氧甲烷营养古菌 Methanoperedens ferrireducens，13C标记、57Fe标记、宏基因组分析及宏转录分析表明该古菌能够以 Fe(Ⅲ)作为末端电子受体独立地介导AOM，但是没有从分子水平进行验证。Leu et al.（2020）在淡水沉积物接种的生物反应器中添加甲烷和锰(Ⅳ)氧化物（水钠锰矿），富集得到的微生物菌群中以 Candidatus Methanoperedens manganicus与 Candidatus Methanoperedens manganireducens（属于Methanoperedenaceae的两个新成员）为主，通过基因组和转录组分析认为它们属于Mn(Ⅳ)依赖型厌氧甲烷氧化菌，但是该研究也没有从分子水平进行验证。

除 Fe(Ⅲ)与 Mn(Ⅳ)外，Se(VI)、Cr(VI)、As(V)、V(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)及 Te(IV)也能介导甲烷厌氧氧化。Lai et al.（2016）在膜生物反应器中以甲烷为唯一电子供体将硒酸盐完全还原为 Se0，并认为甲烷氧化菌属中的 Methylomonas可以在氧化甲烷的同时直接将 SeO42-还原 Se0。Luo et al.（2018）的研究也表明，在厌氧条件下甲烷氧化菌Candidatus Methanoperedens和Candidatus Methylomirabilis能将SeO42-还原为Se0而消除SeO42-的毒性。此外，甲烷氧化菌也能以甲烷为唯一的电子供体将V(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)、Te(IV)、Cr(VI)和 As(V)分别还原为V(IV)（Lai et al.，2018a；Zhang et al.，2020）、Sb(III)（Lai et al.，2018b）、Te0（Shi et al.，2019）、Cr(III)（Al-Hasin et al.，2010；Lu et al.，2016；Dong et al.，2019； Lu et al.，2018；Luo et al.，2019）及 As(IV)（Shi et al.，2020），其相应的主要功能微生物如表1所示。Shi et al.（2020）发现砷污染湿地土壤中的ANME-1和ANME-2a-c能以砷酸盐为电子受体厌氧氧化甲烷，并认为甲烷厌氧氧化和砷酸盐还原是一个以前被忽视的潜在的全球性过程，该过程对砷的迁移和环境污染具有影响。Lu et al.（2016）在间歇式反应器中利用 CH4作为唯一电子供体研究甲烷氧化耦合Cr6+的还原，实验中观测到了甲烷厌氧氧化耦合Cr6+还原现象，并认为ANME-2d可能参与偶联于Cr(Ⅵ)还原的AOM。

表1 文献报道的金属依赖型厌氧甲烷氧化微生物Table 1 Microbes reported as M-DAOM

虽然在将近 20年前就发现了金属依赖型厌氧甲烷氧化，但涉及的微生物仍不是很清楚。目前，研究的主要是非纯培养物。由于缺乏纯培养物，金属依赖型厌氧甲烷氧化的生化研究受到阻碍。因此，从不同厌氧环境中获取金属依赖型厌氧甲烷营养古菌的纯培养物对于更好地从生化层面理解及研究金属依赖型厌氧甲烷氧化机理具有十分重要的意义。

2 金属依赖型厌氧甲烷氧化的机制

M-DAOM微生物包括ANME和产甲烷古菌两个大类，其氧化甲烷的方式目前主要有5种（图2）。其中，前两种方式主要存在于ANME（图2A、B）（He et al.，2018）：（1）ANME（如 ANME-2a、2c、2d）单独完成M-DAOM，即ANME直接将甲烷氧化为CO2，并将产生的电子直接传递到可溶金属离子或金属离子络合物或固体金属氧化物上（Ettwig et al.，2016；Lu et al.，2016；Scheller et al.，2016；Cai et al.，2018；Leu et al.，2020）；（2）ANME与金属还原微生物（Metal-reducing microorganism，MRM）合作共同完成M-DAOM过程（Fu et al.，2016），即首先ANME将甲烷氧化为CO2产生的电子直接传递给MRM，然后MRM利用从 ANME获得的电子将金属氧化物还原。金属依赖厌氧甲烷氧化的后3种途径则主要由产甲烷古菌催化（图2C—E）（何丹等，2020）：（1）产甲烷古菌将氧化甲烷产生的电子直接传递到给金属离子或金属离子络合物或固体金属氧化物，并将其还原（Bar-Or et al.，2017）；（2）产甲烷古菌将氧化甲烷产生的电子传递给电子穿梭体，后者再将金属离子或金属离子络合物或固体金属氧化物还原，从而实现甲烷厌氧氧化（He et al.，2019）；（3）产甲烷古菌将甲烷氧化并产生中间产物（如 H2）（Hoehler et al.，1994），然后MRM再利用产生的中间产物（如H2）将金属氧化物还原（Lovley et al.，1989），从而实现甲烷厌氧氧化。

图2 微生物介导的M-DAOM不同机制（He et al.，2018；何丹等，2020）Fig. 2 Different mechanisms of microbe-mediated M-DAOM(He et al., 2018; He et al., 2020)

He et al.（2018）认为金属氧化物促进S-DAOM也属于 M-DAOM，即首先 ANME将甲烷氧化为CO2产生的电子直接传递给SRB，然后SRB利用从ANME获得的电子将硫酸盐还原为S2-，产生的S2-通过一个隐藏的硫循环过程将金属氧化物还原或与金属氧化物的还原产物生成金属硫化物（CH4+SO42-→HCO3-+HS-+H2O，HS-+2Fe(OH)3+5H+=2Fe2++S0+6H2O，HS-+2FeOOH+5H+=2Fe2++S0+4H2O，Fe2++HS-=FeS+H+），从而促进S-DAOM（Hansel et al.，2015；Sivan et al.，2014b）。但本文作者认为有无金属氧化物存在，S-DAOM过程中微生物都能将甲烷氧化，金属氧化物的存在只是促进了S-DAOM。因此，金属氧化物促进S-DAOM不属于M-DAOM范畴。

目前，报道的微生物介导M-DAOM以金属离子/金属氧化物直接耦合甲烷厌氧氧化的反向产甲烷途径为主。Ettwig et al.（2016）将只含AAA一种古菌的培养物和一系列金属氧化物一起培养，发现加入柠檬酸铁可以促使甲烷发生氧化，而且通过宏基因组分析发现在该富集物中没有其他古菌和已知的铁还原微生物，排除了铁还原菌耦合ANME的可能性，这一切都暗示了AAA能够利用金属离子氧化甲烷。对AAA基因型进行分析，AAA含有反向产甲烷所需的全部基因，并且含有大量编码血红素c型细胞色素的基因（Ettwig et al.，2016）。先前电活性微生物的研究表明血红素c型细胞色素在胞外电子传递中具有重要作用（Rosenbaum et al.，2011；Lovley，2012），因此推测AAA可以通过血红素c型细胞色素将胞内电子传递给胞外电子受体柠檬酸铁。Scheller et al.（2016）发现在含有ANME-2古菌（包括ANME-2a与ANME-2c）的培养基中分别加入 2, 6-蒽醌二磺酸钠（Anthraquinone-2, 6-disulfonic acid Disodium Salt，AQDS）（一种人工电子受体）、腐殖酸、以及铁的配合物（柠檬酸铁和乙二胺四乙酸铁）时均可发生甲烷厌氧氧化现象，主要原因是ANME-2古菌细胞膜表面含有大量血红素c型细胞色素，c型细胞色素可以使AQDS、以及 Fe3+等胞外电子受体接受来自古菌体内通过反向产甲烷途径产生的电子，也就是说 AQDS与Fe3+等胞外电子受体直接充当了末端电子受体的角色。Soo et al.（2016）通过宏基因组与宏转录组分析，证实Fe(Ⅲ)介导M. acetivorans C2A厌氧氧化甲烷时，还原Fe3+等胞外电子受体所需的电子由菌体内通过“反向产甲烷途径”产生。宏基因组分析表明M. ferrireducens具有编码“反向产甲烷途径”及多血红素c型细胞色素的基因，而这些细胞色素c被认为促进异化Fe(Ⅲ)还原（Cai et al.，2018）。宏转录组分析显示Fe(Ⅲ)介导AOM时这些基因上调，这进一步支持M. ferrireducens能够以Fe(Ⅲ)作为末端电子受体，通过“反向产甲烷途径”独立地介导 AOM（Cai et al.，2018）。Leu et al.（2020）以淡水沉积物接种生物反应器，并添加甲烷与水钠锰矿，富集得到的微生物菌群以C. M. manganicus和C. M. manganireducens为主，宏基组及转录组分析显示上述两菌株能够以 Mn(Ⅳ)作为末端电子受体，通过“反向产甲烷途径”独立地介导AOM。

目前，主要根据环境与纯培养物的宏基因组和宏转录组分析推测M-ANME是通过金属离子直接耦合“反向产甲烷途径”机制厌氧氧化甲烷（McGlynn，2017；Timmers et al.，2017），但是并没有从分子水平对该机制的每一步进行验证。由于绝大部分的ANME只能以CH4为底物生长，从而阻碍了从分子水平对该机制进行验证。因此，需筛分、富集获得多底物纯培养物，并以该纯培养物为模式微生物，构建关键酶的基因突变株，研究金属离子介导这些突变株代谢甲烷，以从分子水平对金属离子/金属氧化物直接耦合“反向产甲烷途径”厌氧甲烷氧化的机制进行验证。

3 金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递机制研究

与传统的胞内电子传递不同，金属依赖型厌氧甲烷营养古菌氧化甲烷时需将胞内产生的电子传递到胞外的终端电子。金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞内产生的电子如何穿过细胞膜与胞外电子受体（如Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)）建立“电”联系，是金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递机制研究的热点。金属依赖型厌氧甲烷营养古菌氧化甲烷时会产生辅酶M（CoM-SH）、辅酶B（CoB-SH）、还原态辅酶 F420（Reduced coenzyme F420，F420H2）及还原态铁氧还原蛋白（Fully Reduced ferredoxin，Fdred2-）（Soo et al.，2016；Cai et al.，2018；Yan et al.，2018）。胞内 CoM-SH、CoB-SH、F420H2及 Fdred2-如何被氧化，以及氧化产生的电子如何直接传递到胞外终端电子受体（如Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)）是金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递机制研究需解决的关键问题。

Yan et al.（2018）通过M. acetivorans C2A氧化甲烷时的转录组分析提出了 M. acetivorans C2A Fe(Ⅲ)依赖的厌氧甲烷氧化及胞外电子传递假设途径（见图3）。根据该假设模型，Fdred2-被Rnf complex氧化，产生的电子经细胞色素c传递给Fe(Ⅲ)，并将其还原为Fe(Ⅱ)，从而实现Fdred2-携带的电子传递到胞外电子受体。在人工电子介体蒽醌2, 6-二磺酸钠（Anthraquinone-2, 6-disulfonic Acid Disodium，AQDS）的介导下，与膜结合的异二硫物还原酶HdrDE（Heterodisulfide Reductase subunits D and E）将CoM-SH和CoB-SH氧化，产生的电子经AQDS传递给 Fe(Ⅲ)，并将其还原为 Fe(Ⅱ)，从而实现CoM-SH和CoB-SH携带的电子传递到胞外电子受体，但是AQDS依赖的电子从HdrDE传递到Fe(Ⅲ)的途径不清楚，即HdrDE是直接将AQDS还原为AQDSH2，还是 HdrDE先将氧化态的甲烷吩嗪（Oxidized Methanophenazine，MP）还原为还原态的甲烷吩嗪（Reduced Methanophenazine，MPH2），然后 MPH2（E0= -165 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）再将AQDS（E0= -184 mV vs SHE (Wolf et al.，2009)）还原为AQDSH2。该途径提出，所产生的F420H2通过两种可能的机制被氧化，并将电子传递给胞外电子受体 Fe(Ⅲ)。一种是 F420H2被辅酶F420脱氢酶（F420H2dehydrogenase，Fpo）氧化，产生的电子将MP还原为MPH2，MPH2再将电子传递给胞外电子受体Fe(Ⅲ)，从而实现F420H2的氧化及携带的电子传递到胞外电子受体。但是MPH2位于质膜内，而Fe(Ⅲ)位于胞外，两者之间不能直接接触，因而无法直接传递电子。MPH2与胞外电子受体 Fe(Ⅲ)之间要实现电子传递，必须借助贯穿质膜外表面的媒介（如贯穿质膜外表面的细胞色素或MPH2氧化酶），但是这一媒介仍不清楚。另一种是 F420H2被细胞质中的异二硫物还原酶HdrA2B2C2（Heterodisulfide Reductase subunits A2，B2，and C2，HdrA2B2C2）氧化产生Fdred2-、CoM-SH及CoB-SH，Fdred2-、CoM-SH及CoB-SH再分别被Rnf complex及HdrDE氧化，并将电子传递给胞外电子受体 Fe(Ⅲ)，从而实现 F420H2的氧化及携带的电子传递到胞外电子受体。但是HdrA2B2C2只能氧化 F420H2（E0= -360 mV vs SHE）并还原 Fdox（E°′= -520 mV vs SHE）和 CoMS-S-CoB（E0′= -143 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）产生 Fdred-、CoM-SH及 CoB-SH（图 4）（Yan et al.，2017）。因此，需构建M. acetivorans C2A的cytc、hdrA2B2C2及fpo基因突变株，验证 Cyt c、HdrA2B2C2及 Fpo在 Fe(Ⅲ)介导 M.acetivorans C2A厌氧氧化甲烷时胞外电子传递中的作用，进而从分子水平对M. acetivorans C2A胞外电子传递机制进行验证。

图3 M. acetivorans C2A Fe(Ⅲ)依赖的甲烷氧化及胞外电子传递假设途径（Yan et al.，2018）Fig. 3 Pathway proposed for Fe(III)-dependent methane oxidation and conservation of energy by M. acetivorans (Yan et al., 2018)

图4 胞质异二硫化物还原酶HdrA2B2C2利用CoMS-S-CoB和F420H2还原Fdox假设机制（Yan et al.，2017）Fig. 4 Proposed scheme for the reduction of Fdox with CoM-S-S-CoB and F420H2 by cytoplasmic electron confurcating heterodisul fide reductase HdrA2B2C2 complex (Yan et al., 2017)

Cai et al.（2018）从以氢氧化铁为电子受体、甲烷为底物的实验室生物反应器中富集、分离得了一株厌氧甲烷营养古菌M. ferrireducens，13C-和57Fe同位素标记批次实验表明 M. ferrireducens可实现AOM与Fe(Ⅲ)的还原相耦合。宏基因组分析表明，立地介导 AOM，并通过转录组分析提出了 M.ferrireducens Fe(Ⅲ)依赖的甲烷氧化及胞外电子传递假设途径（图5）。M. ferrireducens沿“逆向产甲烷”途径将甲烷氧化并产生CoM-SH、CoB-SH、F420H2及Fdred2-。HdrDE将产生的部分CoM-SH与CoB-SH氧化的同时将氧化态甲基萘醌（oxidized menaquinone，MK）还原为还原态甲基萘醌（reduced menaquinone，MKH2）。Fdred2-及产生的部分CoMSH与CoB-SH被HdrABC-FrhB complex氧化，氧化产生的电子将F420还原为F420H2，产生的F420H2被Fpo氧化的同时将MK还原为还MKH2。最后，产生的MKH2被Cytb或NfrD氧化并将电子传递给胞外的电子受体 Fe(Ⅲ)，从而实现胞外电子传递。但是 MK/MKH2的氧化还原电位（E0′= -260 mV vs SHE (Kishi et al.，2017)）较 CoM-S-S-CoB/(CoMSH+CoB-SH)的氧化还原电位（E0′= -143 mV vs SHE (Tietze et al.，2003)）低很多，HdrDE无法直接利用CoM-SH与CoB-SH将MK还原为MKH2。因此，图5中HdrDE利用CoM-SH与CoB-SH将MK还原为 MKH2的假设值得探讨。此外，M.ferrireducens只能代谢甲烷，且HdrDE、HdrABCFrhB complex、Fpo、Cytb及NfrD在M. ferrireducens胞外电子传递过程中必不可少，不能通过构建相关酶的基因突变株的方式对相关酶的功能进行验证，因而不能从分子水平对 M. ferrireducens胞外电子传递假设途径进行验证。

图5 M. ferrireducens Fe(Ⅲ)依赖的甲烷氧化及胞外电子传递假设途径（Cai et al.，2018）Fig. 5 Metabolic construction of the putative pathway for AOM coupled to Fe(III) reduction in “M. ferrireducens” (Cai et al., 2018)

Leu et al.（2020）以淡水沉积物接种生物反应器、甲烷为底物及水钠锰矿为电子受体，富集得到的微生物菌群中以 C. M. manganicus和 C. M.manganireducens为主，通过宏基组及转录组分析提出了上述两菌株在 Mn(IV)介导下厌氧氧化甲烷的胞外电子传递假设机制（见图 6）。C.Methanoperedens沿“逆向产甲烷”途径将甲烷氧化并产生CoM-SH、CoB-SH、F420H2及Fdred。HdrDE将产生的部分 CoM-SH与 CoB-SH氧化的同时将MK还原为MKH2。Fdred及产生的部分CoM-SH与CoB-SH被HdrABC-FrhB complex氧化，氧化产生的电子将F420还原为F420H2。产生的F420H2被Fpo氧化的同时将MK还原为还MKH2。最后，产生的MKH2通过 menaquinone：cytochrome c oxidoreductases传递给位于细胞质膜外的多血红素细胞色素c将Mn(Ⅳ)氧化物还原。

图6 Ca. Methanoperedens基因组中AOM与Mn(IV)还原偶联的代谢途径构建（Leu et al.，2020）Fig. 6 Metabolic construction of the putative pathway for AOM coupled to Mn(IV) reduction in the“Ca. Methanoperedens” genomes (Leu et al., 2020)

4 展望

金属依赖型厌氧甲烷氧化对全球碳元素、硫元素、磷元素以及金属元素的循环有着重要影响，是生物地球化学、地质微生物学等许多基础学科的热点课题。尽管近些年在金属依赖型厌氧甲烷营养古菌、甲烷厌氧氧化机制乃至厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递等方面取得了令人振奋的成就，但总体上讲金属依赖型厌氧甲烷氧化仍有太多未解决的问题。尽管强调了金属偶联AOM的全球重要性，但迄今为止，无论是其机制还是所涉及的微生物都缺乏深入研究。由于缺乏足够的纯培养物，金属依赖型厌氧甲烷氧化的生化研究受到阻碍，获取金属依赖型厌氧甲烷营养古菌的纯培养物对于更好地理解及研究金属依赖型厌氧甲烷氧化机理具有十分重要意义。因此，需筛分、富集获得多底物纯培养金属依赖型厌氧甲烷营养古菌，并以该金属依赖型厌氧甲烷营养古菌为模式微生物，从分子水平对金属离依赖型甲烷厌氧氧化的机制进行验证。此外，现有研究也没有从分子水平揭示金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递机制。目前，主要根据环境与纯培养物的宏转录组分析推测金属依赖型厌氧甲烷营养古菌可能的胞外电子传递机制，但是并没有从分子水平对其进行验证。由于绝大部分的金属依赖型厌氧甲烷营养古菌只能以CH4为底物生长，且金属依赖型厌氧甲烷营养古菌纯培养物较少，从而阻碍了从分子水平对金属依赖型厌氧甲烷营养古菌可能的胞外电子传递机制进行验证。

金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递中，HdrDE、HdrA2B2C2、HdrABC-FrhB及Fpo起重要作用，可以以乙酸为底物构建 M. acetivorans C2A的 hdrA2B2C2基因突变株，然后研究 M.acetivorans C2A的hdrA2B2C2基因突变株代谢甲烷以对 HdrA2B2C2的功能进行验证。Fe3+能介导产甲烷菌 Methanosarcina barkeri 800及Methanosarcina barkeri Fusaro氧化甲醇，可以以乙酸为底物构建M. barkeri 800或M. barkeri Fusaro的fpo基因突变株，然后研究Fe3+介导M. barkeri 800或M. barkeri Fusaro的fpo基因突变株代谢甲醇以对 Fpo在胞外电子传递中的作用进行验证。HdrABC-FrhB在产甲烷菌 Methanosaeta harundinacea 6Ac直接利用胞外电子还原CO2产甲烷中起重要作用，可以以乙酸为底物构建 M.harundinacea 6Ac的hdrABC/frhB基因突变株，然后研究产甲烷菌M. harundinacea 6Ac hdrABC/frhB基因突变株直接利用胞外电子还原CO2产甲烷以对HdrABC-FrhB的功能进行验证。吡啶和盐酸羟胺可以抑制HdrDE（Kamlage et al.，1992），因而可研究吡啶和盐酸羟胺对金属依赖型厌氧甲烷营养古菌氧化甲烷的影响以验证 HdrDE在金属依赖型厌氧甲烷营养古菌胞外电子传递中的作用。此外，可以从产甲烷菌中筛选能氧化甲烷的产甲烷菌，并以该类产甲烷菌为模式微生物，构建厌氧甲烷氧化胞外电子传递中涉及的酶的基因突变株，并研究这些突变株氧化甲烷特性，从而揭示这些酶在厌氧甲烷氧化胞外电子传递中的作用。对不同生境中AOM过程和胞外电子传递机理进行深入了解和研究，有助于进一步理解AOM、全球碳循环及生物矿化，并对控制甲烷排放具有十分重要的指导意义。