铜、碘掺杂碳点过氧化物模拟酶比色探针检测茶叶中痕量Pb(II)

程春生，杨德志，李 宏，李秋兰，杨亚玲,

（1.昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；3.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650032）

茶是我国重要经济作物及健康饮料，茶叶中富含茶多酚、多糖、咖啡因等多种活性物质[1]，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等作用[1-2]。茶叶的重金属污染问题严重影响了茶叶的品质，同时也影响了茶产业的健康发展[3]。由于重金属能使人体中的蛋白质变性，以铅为代表的重金属，超过一定浓度会对人体产生一定危害[4]。随着人们环保观念的提升，对茶叶等作物中铅含量的测定也越来越受到重视[5]，如GB 2762—2017《食品中污染物限量》[6]中规定茶叶中铅含量不大于5 mg/kg，DB 440300/T 22—2002《无公害茶叶》也规定茶叶铅含量不大于2 mg/kg[7]。目前，铅的测定方法主要包括原子吸收法[8]、原子荧光法[9]、电感耦合等离子体质谱[10]、电化学法及比色探针法[11-12]。其中比色探针法由于操作简单、快速、不需要复杂仪器设备而备受关注[13]。为了实现Pb(II)的超灵敏度测定，研究通常需要信号放大才能获得良好的灵敏度和低的检测限。

天然酶属于一类兼有专一性和高效性的生物催化剂，具有很大的扩展分析潜力，但天然过氧化物酶容易受到传感条件的影响，在较宽的温度和pH值范围内不能保持较高的催化活性[14]。纳米酶作为一类新型的模拟酶，它具有许多其他传统模拟酶所无法企及的优点[15]，人们可以根据纳米材料模拟酶的特性，进行研究并加以利用，使纳米酶具有更大的应用前景。碳点（carbon dots，CDs）是一种尺寸小于10 nm的新型碳纳米材料，其表面可以修饰不同的官能团[16]。已报道其在过氧化物模拟酶研究中具有很好的前景，特别是金属掺杂CDs[17]。基于金属的可变价态，金属掺杂CDs表现出更优异的过氧化物模拟酶活性。

本研究报道一种通过Pb(II)调节铜、碘掺杂CDs（Cu, I-CDs）过氧化物模拟酶活性，增强比色探针信号测定茶叶中Pb(II)的新方法，如图1所示。由于Cu, I-CDs在酸性条件下催化H2O2产生羟自由基，进一步氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）生成蓝色氧化型TMB（oxidized TMB，oxTMB），Pb(II)存在增强了TMB的氧化，由此建立茶叶中痕量Pb(II)的比色探针检测方法。该方法具有较强的抗干扰能力，共存的其他金属离子及阴离子没有干扰，可用于茶叶中Pb(II)的测定。

图1 基于促进Cu, I-CDs催化活性的Pb(II)检测比色传感器示意图Fig.1 Schematic illustration of the colorimetric sensor for Pb(II)detection based on its ability to promote the catalytic activity of Cu, I-CDs

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化铜（纯度98%）、3-碘-L-酪氨酸（纯度99%）国药集团化学试剂有限公司；TMB（纯度98%） 美国Sigma-Aldrich公司；H2O2溶液（30%） 衡阳市凯信化工试剂有限公司；Pb元素标准溶液（100 μg/mL）国家有色金属及电子材料分析测试中心；所用试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水（电阻率为18.25 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜 荷兰FEI公司；X射线衍射仪、TENsoR27型傅里叶红外光谱分析仪德国Bruker公司；XW-800快速混匀器 上海汗诺仪器有限公司；AA2800石墨炉原子吸收光谱仪 美国安捷伦科技有限公司；HC-3018R型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；120 mL聚四氟乙烯内衬水热反应釜 上海-凯实验仪器有限公司；pHS-3B精密酸度计德国赛多利司公司；AB204-S电子分析天平 美国梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 Cu, I-CDs的合成

分别准确称取1.6 g CuCl2、0.4 g 3-碘-L-酪氨酸溶于20 mL超纯水中，超声10 min使其混合均匀，将溶液转移至聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，于180 ℃恒温加热8 h，反应完成后自然冷却至室温，得棕色溶液。将所得溶液过0.22 μm滤膜以除去大颗粒杂质，再经10 000 r/min高速离心15 min，得到Cu, I-CDs，并于4 ℃下贮存备用。

1.3.2 比色探针测定Pb(II)

在EP管中依次加入65 μL Cu, I-CDs、50 μL 10 mmol/L H2O2溶液和25 μL 150 mmol/L TMB溶液，一定质量浓度的Pb(II)标准溶液，2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀，室温孵育30 min后吸收光谱扫描，以波长654 nm的吸光度进行定量。设定ΔA=A－A0，A为加入Pb(II)后溶液的吸光度；A0为未加入Pb(II)空白时溶液的吸光度。

1.3.3 Cu, I-CDs的催化机制分析

为了揭示Cu, I-CDs作为过氧化物模拟酶与底物的催化过程，在65 μL Cu, I-CDs（35 μg/mL）和2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入不同浓度的H2O2。充分混匀，室温孵育30 min后在波长654 nm的位置进行吸光度测定。典型的米氏方程模型：1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）＋1/Km。V为反应速率/（mol/（L·s））；Km为米氏常数/（mmol/L）；Vmax为最大反应速率/（mol/（L·s））；[S]为底物H2O2浓度/（mmol/L）。

为明晰Pb(II)的增敏机制，以65 μL不同浓度的Cu, I-CDs加到50 μL 10 mmol/L H2O2和25 μL 150 mmol/L TMB溶液中，然后加入不同浓度的Pb(II)，充分混匀，测定吸光度。

1.3.4 样品的消解及Pb(II)的测定

称取茶叶样品0.500 0 g，置于100 mL锥形瓶中，加硝酸10 mL、高氯酸0.5 mL，置于电热板上加热消解。若消化液呈棕褐色，再加少量硝酸，消化至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色。冷却后，用水将试样溶液转入50 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀待测。按照同一方法做空白实验。Pb(II)测定按照1.3.2节方法进行，同时通过GB 5009.12—2017《食品中铅的测定》方法测定以验证研究方法的可行性。

2 结果与分析

2.1 Cu, I-CDs模拟酶的表征

从图2A可以看出，所制备的Cu, I-CDs呈现类球形，分散性较好，且尺寸大约为3～5 nm。如图2B所示，3 445 cm－1位置的峰归属于O—H和N—H的伸缩振动，1 632、l 466 cm－1处的峰为C＝O和C—N的振动特征峰，1 175、1 058 cm－1处的峰分别归属于C—N、C—O的伸缩振动[18-20]。此外，在529 cm－1位置看到C—I的拉伸振动峰[21]。C—I键进一步证明了所制备的CDs中含有碘元素。从以上分析可以得出，Cu, I-CDs表面存在氨基、羧基和其他亲水官能团，导致Cu, I-CDs的水溶性及稳定性较强。从图2C可以看出，在2θ为25.2°处出现一个较为明显的衍射峰，对应于石墨的（002）层面，说明Cu, I-CDs包含类石墨烯结构[22-23]。从图2D可以看到，6 个不同的特征峰，分别为C1s、N1s、O1s、Cu LMM、I3d5和Cu2p[24]，表明该材料存在C、N、O、Cu和I元素，这与图2B的检测结果一致。上述表征结果说明，通过水热法制备的Cu, I-CDs材料较为成功。

图2 Cu, I-CDs的表征分析Fig.2 Characterization of Cu, I-CDs

2.2 比色探针测定Pb(II)的原理

如图3A所示，Cu, I-CDs对TMB的氧化能力稍弱，再加入Pb(II)后其氧化能力显著提高。此外，单独Pb(II)或加入H2O2对TMB几乎没有氧化效果。上述结果表明Cu, I-CDs对H2O2介导的TMB氧化反应具有一定催化作用；当Cu, I-CDs与Pb(II)同时加入H2O2-TMB溶液时，体系的吸光度进一步升高，且随着Pb(II)浓度的增加而逐渐上升。在波长654 nm处，溶液的吸光度及溶液颜色加深程度随Pb(II)浓度增加而增加，且呈现一定的线性关系（图3B）。因此，可以用此吸光度变化的方法实现对Pb(II)的检测。

图3 Pb(II)测定的机理Fig.3 Mechanism of Pb(II) determination

羟自由基可以与苯甲酸反应生成羟基苯甲酸，其在激发波长为330 nm时会产生荧光[25]。为了验证研究体系中羟自由基的产生，分别使用苯甲酸捕捉Pb(II)＋H2O2、Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2体系中产生的羟自由基。结果如图3C所示，Pb(II)＋H2O2体系中几乎无羟自由基产生，而Cu, I-CDs＋H2O2和Cu, I-CDs＋Pb(II)＋H2O2体系中则产生了一定量的羟自由基，因此单独使用Pb(II)无法催化氧化TMB。此外，在加入Pb(II)到体系中后，羟自由基含量明显增加。有研究表明，Pb(II)和Hg(II)等重金属，在一定程度上可吸附在模拟酶表面，从而改变模拟酶表面的性质，从而提升模拟酶的稳定性和催化效果[26]。上述研究结果表明，在Cu, I-CDs＋H2O2体系中加入Pb(II)可有效促进蓝色oxTMB的生成。

2.3 比色探针测定Pb(II)的条件优化

2.3.1 溶液pH值对体系的影响

一般天然纳米酶在酸性环境下会表现出较强的催化活性。为了获得比色探针高灵敏测定Pb(II)的最优pH值，实验选用0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液作为缓冲体系，考察缓冲溶液pH值的影响。如图4所示，缓冲溶液pH值在4.0～5.0范围内，Pb(II)对Cu, I-CDs过氧化物模拟酶活性有明显增强作用，在pH 4.0时催化氧化TMB效果最佳。因此，研究选用pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

图4 溶液pH值对反应体系的影响Fig.4 Effect of pH on the reaction system

2.3.2 底物含量对体系的影响

H2O2在Cu, I-CDs过氧化物模拟酶的催化作用下，能产生羟自由基，其又能进一步氧化TMB产生蓝色oxTMB，因此底物的加入量对Cu, I-CDs过氧化物模拟酶活性有很大影响。如图5A所示，H2O2用量在10～70 μmol/L时，吸光度迅速增加，说明足量的H2O2能促使体系氧化反应更完全；H2O2用量在50～70 μmol/L时，吸光度反而下降，可能是因为过量H2O2使生成的产物进一步氧化，导致吸光度下降。如图5B所示，TMB用量在10～30 μmol/L时，吸光度增加幅度较大；TMB用量在30～50 μmol/L时，吸光度基本平缓但有逐渐下降的趋势，可能是因为在一定量H2O2存在下，过量的TMB不能被H2O2完全氧化，背景值却逐渐增高，因而，体系的吸光度逐渐降低。因此，本实验分别将H2O2和TMB用量定为50 μmol/L和30 μmol/L。

图5 H2O2浓度（A）和TMB浓度（B）对反应体系的影响Fig.5 Effects of H2O2 concentration (A) and TMB concentration (B)on the reaction system

2.3.3 反应温度及时间的影响

如图6所示，在室温（25 ℃）下，反应10 min，吸光度即基本保持稳定，因此本实验选择室温（25 ℃）下反应10 min。

图6 反应温度与时间对反应体系的影响Fig.6 Effects of reaction temperature and time on the reaction system

2.4 Cu, I-CDs过氧化物酶活性的动力学分析

为了揭示Cu, I-CDs作为过氧化物模拟酶与底物的催化过程，研究进行了Cu, I-CDs的酶促反应动力学研究。由图7A可知，在适宜条件下，Cu, I-CDs催化底物H2O2-TMB反应与典型的米氏动力学方程相符合，催化反应随H2O2底物浓度的增加明显增加[27-28]。表明Cu, I-CDs可能先与底物H2O2反应产生羟自由基，进一步氧化底物TMB生成蓝色oxTMB。并用双倒数法[29-30]计算获得米氏常数Km和最大反应速率Vmax（图7B），见表1。结果表明：Cu, I-CDs对H2O2，其动力学参数Km及Vmax都比辣根过氧化物酶高，展示了更高的酶活性。并且Cu, I-CDs＋Pb(II)展现出更好的催化活性。

图7 Cu, I-CDs过氧化物酶活性的动力学分析Fig.7 Kinetic analysis of peroxidase-like activity of Cu, I-CDs

表1 以H2O2为底物的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）的比较Table 1 Comparison of Michaelis-Menten constant (Km) and maximum reaction rate (Vmax) with H2O2 as the substrate

2.5 线性范围、检出限和精密度

在优化后的实验条件下，按1.3.2节方法，加入不同浓度Pb(II)标准液。随着Pb(II)质量浓度增加，溶液颜色逐渐加深（图3B，插图），在波长654 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，Pb(II)质量浓度在0.27～27.02 mg/L范围内呈现较好的线性关系，相关系数（R2）为0.989 6，检出限为34.3 μg/L。

2.6 比色探针对Pb(II)测定的选择性

考察茶叶样品中可能存在的共存离子对比色探针体系的影响。如图8所示，在Pb(II)质量浓度为0.27 mg/L时，分别加入100 倍质量浓度的K＋、Na＋、Cl－；50 倍的Mg2＋、Zn2＋、Ca2＋、Cd2＋、Al3＋、Cu2＋、Fe3＋、NO3－、SO42－、NH4＋；2 倍的Hg2＋、Ag＋。研究结果表明，其他共存离子几乎不会对体系催化oxTMB产生影响，因而测定结果也不存在干扰。上述结果表明，该方法具有良好的选择性和抗干扰效果，可选择性用于Pb(II)的测定。

图8 共存离子对比色探针体系的影响Fig.8 Effects of coexisting ions on the colorimetric probe system

2.7 茶叶样品的测定

先按1.3.4节的湿法消解方法，分别处理并检测了6 个茶叶样品并根据茶叶标准样品（GBW10016和GBW10052）中Pb(II)的浓度进行加标实验。在最优条件下，样品测定结果见表2。结果表明，只有2 个茶叶样品中检出Pb(II)，其余样品均未检出，且样品的加标回收率在92.41%～101.85%范围内。该研究结果符合GB 5009.12—2017《食品中铅的测定》要求的精密度，本研究测定结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于4.47%，表明用本法测定茶叶中Pb(II)结果精密度高、稳定性好。此外，为了验证所建立方法的可靠性，同时用GB 5009.12—2017中石墨炉原子吸收光谱法进行Pb含量测定，2种方法检测表明，二者检测结果较为一致，说明所建立方法的准确度高。

表2 茶叶样品中Pb(II)含量的测定结果（n=6）Table 2 Recoveries and precision of Pb(II) in actual tea samples (n = 6)

3 结 论

本研究建立了一种基于CDs的过氧化物模拟酶的比色探针测定Pb(II)的方法。先以水热法制备Cu, I-CDs模拟酶材料，其可以催化H2O2产生羟自由基，因而可以进一步氧化TMB生成蓝色oxTMB。Pb(II)的存在，可以促进Cu，I-CDs模拟酶催化氧化TMB，产生颜色更深的oxTMB。结果表明，该反应体系对Pb(II)有非常好的选择性，抗干扰性强。在最优条件下，Pb(II)检出限可以达到34.3 μg/L。实际样品测定结果也表明，该研究方法的回收率较高（92.41%～101.85%），准确性好，抗干扰能力强，可用于茶叶中Pb(II)含量的测定。此外，该研究也进一步证明Pb(II)有利于提升模拟酶的催化效果，但其提升模拟酶催化性能的机制还有待进一步研究。