一种新的空肠弯曲菌外膜囊泡提取方法的建立

聂翔，王涓，吴清平，张菊梅，马国祥，汪智,3，唐胜君，潘琪琪，张伟培，肖铠姗

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广东省科学院微生物研究所，华南应用微生物国家重点实验室，广东省微生物安全与健康重点实验室，广东广州 510070）（3.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）

外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs），是一种直径在20～250 nm 之间的球形结构[1-2]，主要由革兰氏阴性菌在生长过程中于细菌表面形成并分泌到胞外[3]，内含脂多糖、外膜蛋白、磷脂及DNA/RNA 等成分[4-6]。1963 年首次通过电子显微镜发现紧挨着细菌细胞壁处存在囊泡状的物质，并认为它可能和细菌的功能有关[7]。直到1999 年，Beveridge 等[8]再次通过电镜观察到OMVs，研究发现其存在多种与致病相关的物质，逐渐引起研究人员的重视。目前研究的焦点主要是OMVs 的生物学功能，如促进生物膜形成，作为毒力基因、活性物质和信号分子等的传输载体，促进细胞间相互交流，与宿主细胞相互作用诱导免疫应答等[9-16]。

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是一种人畜共患的革兰氏阴性菌，广泛分布于鸡鸭等家禽中，从20 世纪80 年代起就受到国内外广泛重视。人感染空肠弯曲菌会导致急性细菌性肠炎，严重者还会导致格林-巴利综合征（GBS）[17]。空肠弯曲菌具有多种潜在的毒力因子，包括细胞毒素[18-19]和各种酶类[20-22]，但缺乏类似其他肠道病原体能直接将效应物传递给靶细胞的经典毒性相关分泌系统[23]。在一些菌株中也发现了VI 型分泌系统（T6SS）的存在，但是对于空肠弯曲菌中T6SS 的功能仍然不是很了解[24-25]。而OMVs是目前发现的另外一种毒力传递机制，它是革兰氏阴性菌中一种独有的分泌系统。现有研究证明空肠弯曲菌OMVs 中确实存在一系列的毒力因子，如能促进空肠弯曲菌入侵肠上皮细胞的细胞质扩张毒素和致病性相关的蛋白酶[21-22]。病原体的一个重要特征是能够感知环境，并适当地改变和调节毒力因子[26]。当空肠弯曲菌的生长温度从37 ℃从改变为42 ℃时，OMVs 的蛋白质丰度也发生了变化，37 ℃时OMVs 中蛋白质PEB4 和PEB1 的丰度增加[27]。在先前的研究中发现PEB4 蛋白在空肠弯曲菌生物膜形成、运动及宿主细胞入侵中起重要作用[28-30]。PEB1 蛋白在与上皮细胞相互作用和在小鼠肠道定植中发挥作用[31]。另外，在空肠弯曲菌培养物中添加牛黄胆酸钠（ST），能增加OMVs 的蛋白水解活性、细胞毒性和肠上皮细胞的免疫原性[22]。因此，OMVs 中含有的各种生物分子对空肠弯曲菌的生存和致病性起到关键性作用。

OMVs的提取是研究OMVs与空肠弯曲菌生物膜形成、耐药性、毒力及与宿主间相互作用的基础。因此，开发一种快速、高效的空肠弯曲菌OMVs 的提取方法具有重要意义。现有研究中超速离心法是OMVs提取的经典方法[26-32]，但其OMVs 回收率低，不适用于OMVs 需求量大的实验。超滤法能收集并提取大量样本中的OMVs，可满足研究要求。因此本研究首先通过比较菌株在不同培养基、培养时间及不同氧气环境下的生长情况，确定空肠弯曲菌在液体环境中的最适生长条件，然后利用超滤浓缩法从培养的菌液中提取OMVs 并对其特性进行鉴定。本研究建立了适用于空肠弯曲菌OMVs 的提取体系，为建立高回收率的OMVs 制备方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

实验所用的空肠弯曲菌为本实验室分离与保存。所有目标空肠弯曲菌鉴定按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》GB 4789.9-2014方法进行。

1.1.2 材料与试剂

血平板、MH 肉汤粉末、布氏肉汤粉末、BHI 肉汤粉末、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、96 孔板，均购自广东环凯微生物科技有限公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸和N-（2-羟乙基）哌嗪-N'-2-乙烷磺酸粉末（HEPES）、氯化钠（NaCl）、乙酸、乙醇、硫代硫酸钠、醋酸钠，均购自广州诺德生化科技有限公司；碳酸钠，购自广州化学试剂厂；硝酸银、甲醛，购自美国Sigma 公司；BCA 蛋白定量试剂盒，购自广州捷威斯生物公司；100 ku 超滤离心管，购自上海优宁维生物科技股份有限公司；超速离心管，购自美国Beckman Coulter 公司。Anti-Major outer 膜蛋白抗体（cj-01）（一抗），购自艾博抗（上海）贸易有限公司；6×protein、Anti-Mouse IgG HRP（二抗）和显影液EasySee® Western Blot Kit，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 仪器设备

二氧化碳培养箱CB220，购自德国BINDER公司；大型高速冷冻离心机J-26 XP，购自德国Beckman avanti 公司；超速离心机（Optima XPN-100）和配套SW32Ti 水平转子，均购自美国Beckman Coulter 公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

将-80 ℃冻存的空肠弯曲菌接种于血平板，42 ℃培养48 h,挑取单菌落于血平板增菌，42 ℃培养48 h。

1.2.2 细菌在液体环境中最适生长条件的优化

（1）1液体培养基

配制MH、布氏及BHI 液体培养基，将增菌后的菌株用棉签从血平板上转移至上述三种不同的培养基中，调整菌液的初始OD600为0.20，42 ℃培养并测定其在液体培养基中的生长曲线，确定空肠弯曲菌液体培养的最适培养基。

（2）2培养时间

菌株增菌后用棉签从血平板上转移至MH 液体培养基中，调整菌液的初始OD600为0.001、0.005、0.01、0.05，42 ℃培养并测定其在液体培养基中的生长曲线，确定空肠弯曲菌液体培养的最适培养时间。

（3）3氧气环境

增菌后的菌株用棉签从血平板上转移至MH 液体培养基中，调整菌液的初始OD600为0.01，将其分别置于大气环境和微需氧环境下培养菌株的生长情况，确定空肠弯曲菌液体培养的最适氧气条件。

1.2.3 超滤浓缩法提取OMVs

将培养后的菌液以4800 r/min，4 ℃离心30 min，收集上清，用0.22 μm 的微孔滤头过滤，将过滤后的上清用截留相对分子质量100 ku 的超滤离心管以5200 r/min，4 ℃离心20 min，重复多次，直至最后的液体体积为原体积的1/6。将浓缩后的上清液转移至超速离心管，29600 r/min，4 ℃超速离心3 h，弃去上清，将沉淀重悬于2 mL 0.01 mmol/L 的磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，用0.22 μm 的微孔滤头过滤鞭毛等杂质，4 ℃保存。

1.2.4 SDS-PAGE 检测OMVs 内的蛋白

配制SDS-PAGE 凝胶，下层为12%的分离胶，上层为6%的浓缩胶。将提取的OMVs 样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经垂直电泳分离后，取下蛋白胶用超纯水清洗，固定液（20 mL 乙醇、5 mL 冰醋酸、25 mL 超纯水）固定30 min，用增敏液（15 mL 乙醇、35 mL 超纯水、0.1 g 硫代硫酸钠、3.4 g 醋酸钠）增敏30 min，超纯水洗三次，每次5 min，随后配制银染液（0.0625 g 硝酸银粉末、25 mL 超纯水、10 μL 甲醛）银染20 min，超纯水洗二次，每次1 min，最后用显色液（1.25 g 碳酸钠、50 mL 超纯水、10 μL 甲醛）显色2～5 min，EDTA（0.73 g EDTA-Na2-2H2O、50 mL 超纯水）反应10 min 终止显色，超纯水洗三次，每次5 min，观察蛋白质条带。

1.2.5 透射电镜观察OMVs 形态

将提取的OMVs 样品滴加到碳包覆铜网上，滴加2%醋酸双氧铀，PBS 洗三次，室温干燥，在电镜下进行检测。

1.2.6 OMVs 总蛋白浓度检测

用BCA 蛋白浓度试剂盒测定提取的OMVs 蛋白质浓度，根据试剂盒说明进行样品处理，用酶标仪进行检测其OD562，根据标准曲线，计算出OMVs 中蛋白浓度。

1.2.7 Western blotting 检测外膜蛋白

（1）1全菌蛋白的提取：将血平板上培养的菌转移到装有1 mL PBS 的离心管中，5880 r/min 离心5 min，去掉上清，沉淀用PBS 重悬，重悬液超声破碎5 min（功率40%），得到全菌蛋白溶液。

（2）2可溶蛋白和膜蛋白的提取：同样将血平板上培养的菌转移到装有1 mL PBS 的离心管中，5880 r/min 离心5 min，去掉上清，沉淀用PBS 重悬，重悬液超声破碎5 min（功率40%），之后8652 r/min 离心5 min，收集上清液在24200 r/min 下超速离心1 h，吸取最上层500 μL 作为可溶蛋白；8652 r/min 离心的沉淀用PBS 洗3 次，之后加入500 μL 1% Triton X-100，8652 r/min 离心5 min，上清为膜蛋白。

（3）3Western blot 分析：取30 μL 空肠弯曲菌的可溶蛋白、膜蛋白、全菌蛋白及OMVs 进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，经垂直电泳分离后，取出蛋白胶，按顺序排好蛋白胶、PVDF 膜和滤纸的位置，排气泡后放入模具内；整个电泳装置置于含冰水混合物的冰盒中，转膜条件为55 V 恒压工作1.5 h；将膜浸泡5%脱脂奶粉中室温封闭液1 h，用PBS-T 溶液洗膜，10 min/次，洗3 次；加入按1:5000 配制的含有一抗的溶液，室温下振荡孵育1 h，用PBS-T 溶液洗3 次；再加入按1:10000 配制的二抗溶液孵育45 min，用PBS-T溶液清洗3 次；配制显影液对PVDF 膜进行显影，曝光时间15 s，用Image Lab 图像分析系统采集图像。

2 结果与讨论

2.1 空肠弯曲菌在液体环境中的最适生长条件

细菌的OMVs 一般是在液体环境下释放的，在对数后期分泌较为旺盛[26]，为保证OMVs 的高回收率，则需要对空肠弯曲菌的液体培养环境进行优化，从培养基、培养时间、培养的氧气环境三方面使其达到最佳的生长状态。首先，探索了气体环境对于空肠弯曲菌的影响，发现在微需氧的条件下，菌株的生长能力更强（图1a），因此，后期的实验均是在此条件下进行。接着，探索了接种量对于空肠弯曲菌的影响，发现接种量越高，菌株的生长能力越强，但其达到对数生长期的时间几乎相似（图1b），均为12 h，为保证OMVs 分泌量，选择15 h 作为菌株在液体培养中的最佳时间。后期选择了较高的接种量进行试验，并探索不同培养基对菌体生长的影响，发现在MH 肉汤中，其OD600能达到0.60，最终菌体密度能达到其他两种培养基的3 倍左右（图1c）。因此，空肠弯曲菌在MH液体培养基中微需氧培养15 h是提取OMVs的最适生长条件，与文献报道相符[27]。

图1 空肠弯曲菌液体培养的最适条件Fig.1 Optimum conditions for liquid culture of Campylobacter jejuni

2.2 OMVs 电镜形态

为更好的研究空肠弯曲菌OMVs的组成部分及生物学性质，需要建立一种快速有效的OMVs提取体系。国内关于空肠弯曲菌OMVs 研究尚未见报道，因此本研究建立了从空肠弯曲菌菌液中提取OMVs 的方法。将提取的样品在电镜下观察，发现均为50～300 nm 间的球形囊泡状结构，符合OMVs 的形态特征（图2）。

图2 OMVs 电镜形态Fig.2 The morphology of OMVs observed by electron microscopy

目前，差速离心法（differential centrifugation）因其工艺简单，底物可重复利用等优点成为分离提取OMVs 最常见最基本的方法[33]。其原理即低速与高速离心交替进行，根据沉降系数的不同依次除去不同的杂质，最终利用超高速离心力使囊泡沉淀在底部达到分离的目的。超滤浓缩法是在差速离心之前，用特定孔径的滤膜进行样品浓缩，提高OMVs 的回收率。根据文献报道[34]，研究人员常采用100 ku 滤膜进行过滤浓缩，本实验中同样采用100 ku 滤膜进行浓缩，电镜下可以看到OMVs 数量较多（图2）。张佳星等[34]利用超滤浓缩提取的铜绿假单胞菌OMVs中存在细胞碎片、鞭毛等多种杂质，而本研究在重悬沉淀之后，用0.22 μm 的微孔滤头对OMVs 进行了过滤，去除了部分杂质，图中仅能看到少数截断的鞭毛（图2）。因此，建立的超滤浓缩法适合于空肠弯曲菌OMVs 的提取。

2.3 OMVs 中的蛋白质含量

注：BSA：胎牛血清蛋白；M：250 ku 的蛋白预染Marker。此前研究表明OMVs 中含有大量蛋白质[6]，因此利用SDS-PAGE 及BCA 蛋白测量试剂盒对提取的OMVs 中的蛋白质进行了测定。SDS-PAGE 鉴定结果显示，OMVs 中包含多种不同大小的蛋白质，其条带范围在15～250 ku 之间（图3）。根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒提供的标准品检测值与对应浓度绘制蛋白浓度标准曲线，并生成标准曲线方程，标准方程为y=0.0004x+0.1108，R2=0.99。通过待测样本OD562值计算待测样品浓度，结果显示提取的OMVs 中蛋白质浓度为40.50 mg/mL（图4）。因此，本研究建立的超滤浓缩法提取体系可在短时间内从较大的样本量中分离得到大量富含蛋白质成分的OMVs。除超滤浓缩法外，另外一些分离OMVs 的方法还有色谱分析法（chromatography）[35]。尺寸排阻色谱法[33]是色谱分析法的一种，其利用分子筛选效应，对通过色谱柱的分子进行分离，可以获得不同分子量的囊泡，但有些分子质量相近的物质无法完全分离。近年来又出现了一些新的分离纯化方法，例如免疫亲和层析分离（immunoamnity isolation）、试剂盒法、声纳过滤系统（acoustic nano-filter system）等[36-37]。免疫亲和层析分离[36]可以利用抗原抗体的相互作用来分离囊泡，虽然分离得到的囊泡纯度非常高，但需要OMVs 中具有特定的抗原，分离后对抗原抗体进行相应检测。因此它分离所需成本较高，且操作步骤较为繁琐。而本研究中超滤浓缩法提取空肠弯曲菌OMVs 仅需4 h 左右便可完成，时间短，且操作简单。

图3 空肠弯曲菌OMVs SDS-PAGE 鉴定Fig.3 Identification of Campylobacter jejuni OMVs by SDS-PAGE

图4 OMVs 的蛋白质浓度Fig.4 Total protein concentration of OMVs

2.4 OMVs 验证

图5 空肠弯曲菌OMVs 的Western blot 分析Fig.5 Western blot analysis of outer membrane protein of Campylobacter jejuni

目前研究报道[38]OMVs 是由外膜突起形成的，且含有外膜蛋白的成分，因此实验选用空肠弯曲菌Anti-Major outer 膜蛋白抗体（cj-01）靶向超滤浓缩法分离得到的产物，进而表征提取物中的主要成分是否为OMVs。Western Blotting 结果显示，空肠弯曲菌的可溶蛋白没有条带，而膜蛋白、全菌蛋白及OMVs 均显示出46 ku 的正确条带，证明了OMVs 的存在。

3 结论

综上所述，本研究首先确定了空肠弯曲形成最佳条件，通过超滤浓缩法从菌液中提取OMVs，通过透射电镜、蛋白质含量测定、特定外膜蛋白抗体等实验分别对其形态、纯度、含量及成分进行分析，表明本文所建立的方法OMVs 提纯效率高、质量较好。因此，本研究成功建立了一种从液体培养基中提取空肠弯曲菌OMVs 的提纯体系，为后续研究空肠弯曲菌中OMVs 生物学功能提供技术支持。