豌豆组织化蛋白品质因子分析及工艺优化

张光耀，彭慧慧，张静，王思花，戚明明，任志尚，贺壮壮，马成业,2*

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255000）（2.山东省高校农产品功能化技术重点实验室，山东淄博 255000）

随着全球人口增长，世界范围内对肉类需求增加，而盲目增加畜牧业会占用大量耕地和造成环境污染，且长期食用动物肉有诱发营养相关疾病和食源性疾病的风险[1]。植物蛋白组织化产品作为肉类替代品，一定程度上满足人类对蛋白质的需要。豌豆蛋白作为一种优质蛋白，氨基酸组成较平衡，在人体内含有的8种必须氨基酸中，除蛋氨酸外其他氨基酸均达到FAO/WHO 推荐值[2]。豌豆蛋白是生产豌豆淀粉的副产物，绝大部分用来加工饲料，造成很大的资源浪费[3]。因此，对豌豆蛋白进行挤压改性用于食品加工，开发利用潜力还很大[4]。

高水分挤压组织化技术具有高效低成本等特点，在食品加工中应用广泛[5]。植物蛋白高水分挤压组织化产品也被越来越多的人接受[6-8]。我国豌豆资源丰富，作为无麸质食品中一员，豌豆蛋白不会像大豆一样会造成过敏，也无转基因风险，营养价值高[9-11]，有降低人体胆固醇水平和血压、平衡血糖等功效[12-13]。近几年来，随着国内外对豌豆蛋白研究不断加深，其作为大豆或动物蛋白的替代品已得到广泛的功能性应用[14]。Alonso 等[15]发现挤压蒸煮导致豌豆蛋白结构变化，形成具有较高持水性、较低持油性和溶解度的三维网状结构。Osen 等[16]将豌豆蛋白通过挤压形成类似肌肉质地的纤维状产品，发现其制品可以作为肉类的良好替代品。王旭等[17]、杨震等[18]研究了豌豆蛋白挤压组织化工艺，并探究了其在肉制品中的应用。对于豌豆蛋白高水分挤压组织化产品的评价，还需要建立一套更为科学的体系，对于评价指标和评价方法，还需要进一步筛选和统一[19-20]。

本研究基于前人研究植物蛋白组织化技术上，对豌豆组织化蛋白进行研究分析。对螺杆转速、机筒温度、水分根据Box-Behnken 中心设计原理制定三因素三水平组合试验，对所得豌豆蛋白组织化产品进行指标测定。进行相关分析，探究指标间相互关系，寻找更好反映产品品质的因子和指标[21-22]。本研究可拓宽植物蛋白挤压组织化技术研究范围，丰富豌豆蛋白组织化技术研究内容，为完善豌豆蛋白组织化产品评价体系、豌豆蛋白组织化产品质量评测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 原料

豌豆蛋白粉，购于山东健源生物科技有限公司，基本化学成分为蛋白质75.49%、淀粉7.31%、脂肪0.87%、粗脂肪7.92%、水分4.67%、灰分3.74%。

1.2 试验设备

工程食品双螺杆挤压平台，UVTE36-24 型，长沙创享食品科技有限公司；质构仪，FTA-3000M 型，美国Brookfield 公司；色差计，CM-3600A，日本柯尼卡美能达控股公司；凯氏定氮仪，ATN-300，上海洪纪仪器设备有限公司。

本试验中所用工程食品双螺杆挤压平台，由动力系统、挤压单元、温控系统、成型单元及其他辅助单元构成。采用模头为15×45 mm（模孔）的圆形模头，模头连接成型模具：长1000 mm，出料口截面尺寸长170 mm，宽15 mm。

1.3 Box-Behnken 试验设计

根据Box-Behnken 中心设计原理对螺杆转速、机筒温度、水分设计三因素三水平组合试验，进行工艺优化。试验设计及结果如表1 所示。

表1 Box-Behnken 试验设计和结果Table 1 Box-Behnken experiments design and result

其中机筒温度设置，套筒共有五个温区，这里改变主温区，即Ⅲ区。I 区40 ℃；Ⅱ区120 ℃；Ⅳ区145 ℃；Ⅴ区140 ℃在挤压过程中保持不变。喂料速度为10 kg/h。原料从固体喂料器以额定速率出料，经进料口进入挤压机输送模块，向前输送过程中，水由液体喂料器泵入挤压机，混合物料在挤压机啮合模块经熔融、剪切、挤压，后经模头进入挤压成型模块，从出料口成型，定时称取产品，保温箱保存，备测。

1.4 评价方法

1.4.1 产品品质指标测定

组织化度：取边长1 cm 的正方体样品供测量，相邻两个样品分别测量平行挤出方向和垂直挤出的剪切功。每个样品测定6 组。用剪切力大小来表征剪切强度的大小，用横切所做的功与纵切所做的功的比值定量表征组织化程度，即组织化度[10]。质构仪操作参数：探头BSW，测试前速度1.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测试后速度2.0 mm/s，剪切程度75%。

硬度、弹性、粘结性：垂直于挤出平面取直径1 cm的圆柱形样品用质构仪测定。质构仪操作参数：TPA模式，探头P/36R，测试前速度2.0 mm/s，测试速度1.0 mm/s，测试后速度2.0 mm/s,下压程度50%，间隔时间5 s，往复运动两次。

吸水性：将样品切碎成块，60 ℃条件下在烘箱烘干4 h，用超微粉碎机粉碎，过80 目筛。取干燥样品10 g（称重后计为W1），60 ℃复水2 h，取出后置于阴凉处5 min 后称重（重量计为W2）按下述公式计算：

持油性：称取与吸水性测定相同的干燥样品5 g，放入100 mL 离心管中并往其中加入30 mL 植物油，使用玻璃棒搅拌均匀，样品静置3 min 后，在离心机中以3500 ×g 的转速离心15 min。移去离心液中上清液，使用滤纸将管壁内残油吸干，然后将离心管与沉淀同时称重，持油性（OHC）按照以下公式进行计算，每种样品3 组平行试验求平均值：

式中：

M2——离心管与离心后沉淀；

M1——离心管与样品重；

M——样品重。

可溶性氮含量：将样品在60 ℃条件下烘干4 h，取5 g 干燥样品置于100 mL 蒸馏水中，在30 ℃下磁力搅拌器以120 r/min 搅拌1～2 h，过滤定容至100 mL，吸取0.5 mL 样品溶液，0.5 mL 蒸馏水放入10 mL 具塞试管中，用考马斯亮蓝G-250 染色法测定氮含量，氮含量计为A[23]。总氮含量采用凯氏定氮法（GB 5009.5-2016）进行测定计为B。

色差：用色差计测定，测定参数为L*、a*、b*。每样品重复测量五次取平均值，按下述公式计算色差值。

式中：

ΔE——样品与白色板的色差，值越小表示颜色越接近白色板。

1.4.2 感官评价

豌豆组织化蛋白感官评价从颜色、组织化、质构性、味道四个方面进行[18]，总分100 分，每项占25分。颜色：色泽呈褐色且发黑0～10 分，微黄且色泽不均10～18 分，黄色且色泽均匀18～25 分。组织化：存在粉状、部分结为小块0～10 分，过度蓬松且没有粉状以及块状10～18 分，略微蓬松且没有粉状以及块状18～25 分。质构性：较脆并且受力成渣0～10 分，弹性较好且受力呈现部分纤丝状10～18 分，弹性较好且受力呈现纤丝状18～25 分。味道：腥味严重0～10分，存在轻微腥味10～18 分，无腥味18～25 分。

1.4.3 数据处理

用SAS 9.3 进行统计量分析、相关性分析、因子分析，用Design-Expert 8.0.6 进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果

2.2 描述统计量

不同挤压样品的硬度、弹性、粘结性、吸水性、吸油性等9 项指标平均值、标准差、中位数和变异系数如表2 所示。变异系数消除了量纲影响和测量尺度，反映了指标离散程度。由表2 可知，变异系数按从大至小顺序排列，依次为硬度、组织化度、感官评价、可溶性氮、吸水性、持油性、ΔE、粘结性、弹性。

表2 样品表述统计量Table 2 Descriptive statistics of the quality properties

2.3 相关性分析

豌豆组织化蛋白各指标相关性分析结果如表3所示。硬度与吸水性之间呈极显著负相关关系，与ΔE之间呈极显著正相关关系，说明硬度小的挤压产品具有更好的网状结构，具有更好的保水性。吸水性与ΔE之间呈极显负相关关系。这说明较高保水性的网状需要与更多的水分反应形成，颜色也偏浅，这与Alonso等[15]的研究结果一致。硬度较小时，水分含量较高，吸水性好。同时水分的高低影响ΔE，水分升高，ΔE变小，水分降低，ΔE变大。弹性与持油性之间呈显著负相关关系。粘结性与感官评价呈极显著负相关关系，与组织化度之间呈显著负相关关系。这说明粘结性大时，产品组织化度变小，感官评价低。组织化度高低，对产品口感影响较大，组织化度越大口感越好，因此感官评价与组织化度之间呈极显著正相关关系。

表3 豌豆蛋白组织化指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of pea textured protein indexes

2.4 主因子分析

对实验结果进行主因子分析，得出相关系数矩阵特征值及累计方差贡献率。前4 个主因子累计方差贡献率达83.51%，说明前4 个因子的信息特征量占总体信息的83.51%，可反映9 个指标数据的大部分信息。因此，前4 个因子被保留，得出因子载荷阵，将其进行方差最大正交旋转，使因子载荷阵结构更加清晰，结果如表4 所示。

由表4 可知原始指标与新构造综合因子的相关程度。各指标在不同因子中载荷值的最大值将该指标归属于不同因子，同一因子中各指标间存在紧密联系[24]。因子1 中，硬度、吸水性、ΔE载荷值较大，说明因子1 对这3 个因素起支配作用，主要反映产品的质地和色泽。因子2 中，粘结性、感官评价、组织化度载荷值较大，说明因子2 对此三个因素起支配作用，主要反映产品感官品质。因子3 中，弹性和吸油性载荷值较大，说明因子3 对此两个因素起支配作用，主要反映产品弹性和吸附能力。因子4 中只有可溶性氮载荷值较大，说明可溶性氮指标相对独立，与其他指标其他指标相关性较低。

表4 特征值与方差最大正交旋转后的因子载荷阵Table 4 The eigen value and the factor loading matrix after revolving counterchange

综合考虑指标间相互关系、该指标变异系数大小和各指标在其公共因子中载荷值大小，豌豆组织化蛋白的评价指标权重可暂定为硬度（25%）、组织化度（25%）、感官评价（25%）、吸水性（25%）。

2.5 响应面法优化制备工艺

根据分析结果，现将硬度、组织化度、感官评价作为主要指标，进行响应面分析。

以螺杆转速（x1）、机筒温度（x2）、水分（x3）为自变量，以硬度（R1）、组织化度（R2）、感官评价（R3）、吸水性（R4）分别为响应值，通过软件Design-Expert进行数据分析，建立模型如下：

方差分析见表5。

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis

2.5.1 硬度响应面分析

由表5 可知，自变量与因变量之间回归模型显著（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05）。方差分析显示，模型拟合度R2值为0.9847，校正拟合度Adj R2值为0.8827，回归模型可信。响应面分析表明（图1a～c），当机筒温度一定时，产品硬度受螺杆转速的总体影响不大，呈现先减小后增大的小范围变化。较低螺杆转速下，物料在挤压机中滞留时间长，受热增加，产品硬度变大。而螺杆升高至适当转速时，挤压模块与成型模块压力、出料速度吻合，挤压机状态稳定，压力变小，产品硬度变小。而在较高的螺杆转速下，物料在模头处停留时间加长，受到压力增大，硬度增大。当螺杆转速固定，随着机筒温度上升，产品硬度先减小后增大。较低的温度下，物料和水在挤压机中的熔融反应不充分，挤压出的产品有板结成块的趋势，组织化程度低，硬度大。随着温度升高，水和物料的熔融反应逐渐充分，升温给予水足够能量且不至其过量蒸发，更多水分会被固定在产品中，产品硬度降低。当温度再升高时，水分蒸发作用明显，产品颜色变深，有焦糊的趋势，硬度变大。水分是影响硬度最大的因素，水分升高硬度降低，为负效应，但水分过高，产品呈散碎状而很难成型。较大水分和较高机筒温度可降低产品硬度，这与康立宁等人对大豆蛋白研究结果一致[25]。螺杆转速和机筒温度对硬度的影响相对较小，与挤压原料不同存在一定关系。根据实验结果，硬度取最小值9231.54 g 的与最大值18354.1 g 的中间值13792.8 g 为目标值，进行工艺优化。

图1 挤压参数交互作用结果图Fig.1 Result graph of extrusion parameter interaction

由表5 中F 值大小可知，操作参数的影响大小为：C＞B＞A，即水分＞机筒温度＞螺杆转速。在目标值下得到的最佳工艺参数为螺杆转速148.32 r/min，机筒温度169.73 ℃，水分55.79%。

2.5.2 组织化度响应面分析

由表5 可知，自变量与因变量之间回归模型显著（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05）。方差分析显示，模型拟合度R2值为0.9258，校正拟合度R2Adj值为0.8305，回归模型可信。响应面分析表明（图1d～f），当其中一个操作参数固定时，组织化度会随着另外一个参数的升高先升高再降低。较低的水分会使得原料无法充分熔融，产品组织化程度低，水分过高会使产品呈散碎状。较低的螺杆转速使原料在挤压机中停留时间过长，产品成型过程中挤压过程变长，导致平行挤出方向与垂直挤出方向的纤维差别不明显，组织化度变小，而较大的螺杆转速，原料滞留时间短，在啮合模块成型不够，同时受模头压力影响，物料在模具前端形成不规则的弯曲条纹，组织化度变小。当机筒温度较低时，蛋白质不能充分熔融变性，导致组织化度较低，而温度过高，水分蒸发快，易形成气泡，产品成型变差，组织化度降低，颜色变深，温度偏高或偏低都导致产品组织化度降低，这与孙志欣等人的研究结果是一致的[26]。

由表5 中F 值大小可知，操作参数的影响大小为：B＞A＞C，即机筒温度＞螺杆转速＞水分。以组织化度最大值为响应值，预测值为1.75，通过响应面分析，得到最佳参数为螺杆转速151.71 r/min，机筒温度167.34 ℃，水分54.93%。

2.5.3 感官评价响应面分析

由表5 可知，自变量与因变量之间回归模型显著（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05）。方差分析显示，模型拟合度R2值为0.9345，校正拟合度Adj R2值为0.8502，回归模型可信。响应面分析表明（图1g-i），当机筒温度、水分分别固定时，感官评价随着温度的上升先增大后减小，较低温度下，产品成型韧性差无光泽，组织化不明显。当温度过高时，产品容易变硬发黑，口感差，此两种情况感官评价低。温度适当时，产品色泽好，纤维状明显，产品感官评价高。当水分、温度分别固定时，感官评价随螺杆转速的变大先增大后减小，与郎珊珊等[27]的研究结果一致。较高和较低的转速都不能使物料充分熔融反应，较低转速下物料受热过多压力小，较高转速下物料压力大而受热少，物料成型差，硬度大口感差，感官评价低。当螺杆转速、机筒温度固定时，感官评价随水分增大先升高后降低，变化明显。水分较低时，挤出产品表面粗糙不均匀，硬度大，色泽黯淡，咀嚼感差，感官评价低。水分增大，挤出产品品质改善，色泽变浅，表面光滑，纤维状明显，感官评价高。当水分较大时，挤出产品散碎，感官评价低。总体来说，水分是影响感官评价的主要因素，这与Lin 等[28]的研究结果是一致的。

由表5 中F 值大小可知，操作参数的影响大小为：C＞A＞B，即水分＞螺杆转速＞机筒温度。以感官评价最大值为响应值，预测值为80 分，通过响应面分析，得到最佳参数为螺杆转速151.59 r/min，机筒温度170.45 ℃，水分56.23%。

2.5.4 吸水性响应面分析

由表5 可知，自变量与因变量之间回归模型显著（p＜0.05），失拟项不显著（p＞0.05）。方差分析显示，模型拟合度R2值为0.8313，回归模型可信。响应面分析表明（图1j～l），当温度处于低水平时，吸水性与螺杆转速呈现正效应。温度处于高水平时，吸水性与螺杆转速呈现负效应。由于在温度和螺杆转速都处于低水平情况下，产品的变性不充分，随着螺杆转速上升，物料受到的剪切力增大，压力也增大，蛋白质变性程度增加，因此吸水性与螺杆转速之间呈现正效应。当机筒温度处于高水平时，水受热运动加快，压力升高，而低螺杆转速可减缓物料流动速度，产品成型好，吸水性高。这与杨勇等[29]的研究结果不一致，杨勇等[29]认为当机筒温度固定时，挤压产品吸水性随螺杆转速增大呈现先增大后减小的趋势。当螺杆转速处于低水平时，产品吸水性与机筒温度温度之间呈正效应。当螺杆转速处于高水平时，产品吸水性与机筒温度之间呈负效应。当水分固定时，产品吸水性随着螺杆转速呈现先升高后降低的趋势，但总体变化幅度不大。而当螺杆转速固定时，产品吸水性随着水分的增加呈上升趋势。由二次回归方程可知，水分因素对吸水性的影响显著。

由表5 中F 值大小可知，操作参数的影响大小为：C＞A＞B，即水分＞螺杆转速＞机筒温度。结合产品实际以及参考植物蛋白组织化产品的特点，以中间值153.9%作为目标值，通过响应面分析，得到最佳参数为螺杆转速168.82 r/min，机筒温度167.20 ℃，水分56.64%。

以硬度13792.8 g、组织化度和感官评价的最大值、吸水性153.9%作为目标值，综合响应面分析结果和操作实际，经优化后的工艺参数为螺杆转速153 r/min，机筒温度170 ℃，水分56%。在此工艺条件下进行三组平行试验，所得产品指标硬度为13814.24 g，组织化度1.74，感官评价79，吸水性151.21%，工艺参数得到了优化。这与王旭等[18]、杨震等[19]的研究结果有差异，可能与成型模块结构不同以及原料的差异有关。

3 结论

国内外对豌豆组织化蛋白的评价主要集中在质构、色泽和感官评价等指标上，不同工艺的组织化蛋白指标分析中，硬度、组织化度、感官评价变异系数达40%以上，在反映产品质量时较为重要。通过对产品硬度、组织化度等指标进行相关分析、因子分析。结果表明：硬度、组织化度、感官评价、可溶性氮、吸水性、持油性的变异系数较大。ΔE虽然变异系数不大，但在相关分析中，其与硬度和吸水性分别呈极显著正、负相关关系，说明ΔE为综合指标，可大体反映产品品质。与9 项指标可以归结为4 个主要因子，因子1 对硬度、吸水性、ΔE起支配作用，因子2 对粘结性、感官评价、组织化度起支配作用，因子3 对弹性和吸油性起支配作用，因子4 只对可溶性氮起支配作用，可溶性氮与其他指标联系较少。豌豆组织化蛋白评价指标及权重为硬度（25%）、组织化度（25%）、感官评价（25%）、吸水性（25%）。对硬度、组织化度、感官评价、吸水性进行响应面分析，经优化后的工艺参数为螺杆转速153 r/min，机筒温度170 ℃，水分56%。本研究为豌豆组织化蛋白的评价提供了参考，优化生产工艺，为豌豆蛋白组织化技术的进一步研究奠定基础。但因为挤压机内部为“黑箱”，物料在其中的化学变化难以描述和测定，还有待继续研究。另外，如何开发更为优质的豌豆蛋白组织化产品，仍有着巨大的研究空间和市场价值。