PAK6、ZNF217、G蛋白偶联受体48基因在膀胱癌演进过程中的表达变化

蒋利明, 田大伟, 刘胜来, 张羽

1天津医科大学中新生态城医院外科(天津 300467)； 2天津医科大学第二医院泌尿外科(天津 300211)

膀胱癌源自膀胱上皮细胞，研究显示，膀胱癌在世界范围内的发病率处于全部恶性肿瘤的前10位，在我国的发病率处于泌尿系统恶性肿瘤的首位，且其发病率呈现为逐年升高的趋势[1-2]。流行病学调查显示[3]，膀胱癌可发生与各个年龄段，多发于65岁以上男性，男性高于女性，但目前受多种因素的影响，膀胱癌的发病人群逐渐年轻化，严重影响着患者的生存质量和生命健康。目前临床上对膀胱癌的发病机制尚不完全明确，且缺乏特异性评估患者疾病进展的指标，基于此背景，在本研究中，分析P21活化激酶6(PAK6)、锌指蛋白217(ZNF217)、G蛋白偶联受体48(GPR48)在膀胱癌演进过程中的表达变化，为临床上膀胱癌的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年12月至2019年12月于我院就诊且行手术治疗的138例膀胱癌患者，其中男67例，女71例，年龄35～68岁，平均(48.93±15.67)岁，肿瘤直径：≥5 cm 68例，<5 cm 70例；低分化84例，中分化32例，高分化22例；临床分期：Ta期38例，T1期27例，T2期22例，T3期29例，T4期22例；42例有淋巴结转移；浸润深度：肌层浸润73例，非肌层浸润65例。并对患者行为期6个月的随访统计复发情况，其中复发26例，未复发112例。所有患者及家属均对本次研究知情，签署知情同意书，并经过我院伦理委员会批准。

纳入标准：(1)经病理学组织学确诊为膀胱尿路上皮癌；(2)均未接受过放疗、化疗、免疫治疗。

排除标准：(1)其他肿瘤者；膀胱手术史者；(2)感染者；心、肺、肝等重要脏器障碍者；(3)接受过免疫、放化疗者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 取手术切除的膀胱癌组织及癌旁组织(距离癌基底边缘≥5.0 cm正常膀胱组织)标本，在10%的甲醛溶液中固定，脱水、包埋后，制作5 μm组织切片，设置恒温箱温度为58℃，烘烤 2 h，在二甲苯中脱蜡处理30 min，然后浸在梯度乙醇中各5 min，之后用无菌蒸馏水洗涤5 min。加入柠檬酸钠抗原修复液在沸水中水浴20 min，冷却到室温后用PBS冲洗3次(每次5 min)。分别滴加PAK6、ZNF217、GPR48抗体(1∶200)，在4℃的湿盒中过夜保存，第2天将湿盒取出后复温处理1 h，采用PBS洗片3次(每次5 min)。之后加入二氨基联苯胺(1∶50)进行显色处理1 min，最后加入蒸馏水反应终止。加入苏木素进行复染，盐酸乙醇分化后，梯度乙醇进行脱水，二甲苯冲洗片3次直至透明，采用中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况。随机选取5个视野，所有病理切片均由2位以上经验丰富的医师采用双盲法进行诊断。依据染色程度和染色细胞百分比进行评估：阳性细胞数<10%为-，10%～25%为+，26%～75%为++，>75%为+++。

1.2.2 实时荧光定量PCR(RT-PCR)法 采用RT-PCR法检测癌组织、癌旁组织中PAK6、ZNF217、GPR48 mRNA的表达量，取癌组织、癌旁组织，利用Trizol法提取癌组织、癌旁组织总RNA，使用紫外分光光度仪检测所提取的RNA纯度，总RNA纯度鉴定运用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。利用PCR试剂盒合成cDNA。逆转录：14 μL模板RNA、2 μL Enzyme mix，4 μL 5×RT缓冲液，补至20 μL，PCR检测仪42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后将所合成的cDNA置于-20℃环境下保存。反应体系为：8μL cDNA模板、10 μL SYBRP Green mix、2 μL PCR Primer mix。反应条件为：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 1 min，40个循环。以β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt方法计算癌组织、癌旁组织PAK6、ZNF217、GPR48 mRNA表达量。PAK6引物序列：上游：5′-CCCACCCCAAACCCTATCT-3′，下游：5′-ACACATGGATGCCTGTGACC-3′；ZNF217引物序列：上游：5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3′，下游：5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3′；GPR48引物序列：上游：5′-TGTTTCAACCTTTTAAAGACTGTAGC-3′，下游：5′-TAAAGGACTTAATGCCAAATGTGAT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。

2 结果

2.1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌组织、癌旁组织中的表达情况比较 与癌旁组织相比，癌组织中PAK6表达量显著降低，ZNF217、GPR48表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌组织、癌旁组织中的表达情况比较

图1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌组织、癌旁组织中的表达(免疫组化，×200)

2.2 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演进过程中的表达情况分析 PAK6、ZNF217、GPR48表达与膀胱癌患者性别、年龄、肿瘤直径无关，差异无统计学意义(P>0.05)；PAK6、ZNF217、GPR48表达与膀胱癌患者分化程度、临床分期、有无淋巴结转移、浸润深度、复发情况相关，与中高分化、Ta～T1期、无淋巴结转移、非肌层浸润、未复发患者相比，低分化、T2～T4期、有淋巴结转移、肌层浸润、复发患者的PAK6表达量降低，ZNF217、GPR48表达量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演进过程中的表达情况分析

2.3 PAK6、ZNF217、GPR48之间相关性分析 PAK6、ZNF217、GPR48之间相关性分析显示，PAK6与ZNF217之间呈负相关(r=-0.219，P=0.010)；PAK6与GPR48之间呈负相关(r=-0.309，P=0.001)；ZNF217与GPR48之间呈正相关(r=0.193，P=0.023)。见图2。

图2 PAK6、ZNF217、GPR48之间的相关性分析

3 讨论

部分研究认为，膀胱癌的发生是多种因素共同作用的结果，属于一种较为庞大、复杂的网络，在各种因素的刺激下，促进肿瘤细胞异常增殖、迁移，增殖失控，最终诱导肿瘤的进一步进展[4]。本研究为寻找促进膀胱癌演进的敏感指标，分析PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演进过程中表达变化，明确三者是否参与此病的进展，为临床上此病的诊治提供参考。

P21活化激酶(PAKs)属于一种在进化上较为保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，属于小G蛋白Rho家族Cdc42、Rac1的下游靶向因子，临床上根据其结构和序列同源性分为两类，即为包括PAK1、PAK2、PAK3在内的Ⅰ类PAKs和包括PAK4、PAK5、PAK6在内的Ⅱ类PAKs，与肿瘤细胞的运动、生存、基因转录调节、细胞迁移、周期变化等生物学行为相关[5-7]。PAK6属于PAKs家族成员之一，属于一种与雄激素受体发生相互作用的激酶蛋白，其活性受p38 MAPK、MKK6所调控，具有抑制雄激素受体介导的核转录过程[8]。研究发现[9-10]，PAK6在恶性肿瘤的发生发展过程中具有双重作用，在肺癌、前列腺癌、胰腺癌等癌组织中呈现为异常高表达，促进肿瘤细胞增殖失控，促进疾病进展；在肾透明细胞癌中呈现为异常低表达。研究显示[11]，PAK6可经雄激素受体信号转导通路参与膀胱癌的发生发展。本研究结果显示，PAK6在膀胱癌组织中低表达，且与患者分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度、复发情况相关，此结果提示PAK6可能经雄激素受体信号转导通路刺激肿瘤细胞异常增殖，进而促进疾病进展，在此病的演进过程中具有重要的意义。

ZNF217属于kruppel样转录因子家族成员之一，具有1个富含脯氨酸基序、8个C2H2锌指基序，可经过与其特定的DNA序列结合后对特定的基因表达进行调控[12]。有研究显示[13-14]，ZNF217同时也是一种组蛋白去乙酰化酶复合物的组成蛋白，可经参与多个c端结合蛋白复合物抑制相应的基因转录过程。临床研究发现，ZNF217在恶性肿瘤的发生发展中具有重要的意义，经介导多种信号转导通路参与恶性肿瘤的演进过程，ZNF217可经促进ErbB3表达降低，抑制乳腺癌细胞增殖[15]。ZNF217可经激活PI3K/AKT信号转导通路，促进卵巢癌细胞增殖[16]。另外有研究显示[17]，当ZNF217出现异常高表达后，可在一定程度上促进肿瘤细胞异常增殖和迁移，促进疾病进一步进展、恶化。本研究结果显示，ZNF217在膀胱癌组织中高表达，且与患者分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度、复发情况相关，此结果提示PZNF217异常高表达与疾病进展相关，在此病的演进过程中具有重要的意义。

细胞内环境的稳定和活动与信号转导通路相关，在此过程中细胞表面的膜受体具有重要的意义，G蛋白偶联受体属于一种最大的膜蛋白家族，其具有7个跨膜结构，可经过与多种膜信号分子的特异性结合作用参与免疫反应、肿瘤发生发展、内环境稳定调节、行为、情绪控制等多种生理病理过程[18-19]。临床上将G蛋白偶联受体分为A、B、C型三种，其中GPR48属于G蛋白偶联受体家族超家族的A10亚型，其位于激素结合区域，在多种组织器官发育中具有重要的意义[20]。研究显示[21-22]，GPR48其异常表达参与多种疾病的发生发展，其失活可诱发先天性AGR综合征的发生，其基因突变可增加胆道扁平细胞癌、皮肤癌的发病率，可经作用于Jmjd2a/AR信号通路诱导前列腺癌的发生。目前临床上对于GPR48与膀胱癌的关系研究较少，仅有季德才等[23]、王俊勇等[24]认为GPR48基因在膀胱癌组织中异常高表达。基于上述研究背景，本文分析GPR48与膀胱癌演进的关系，结果显示，GPR48在膀胱癌组织中高表达，且与患者分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度、复发情况相关，此结果提示GPR48异常高表达与疾病进展相关，在此病的演进过程中具有重要的意义。

另外本研究还对PAK6、ZNF217、GPR48三者之间相关性进行分析，结果显示，PAK6与ZNF217、GPR48均负相关，ZNF217、GPR48之间正相关，提示着三者可能共同参与膀胱癌的发展过程，但目前临床上对于三者与膀胱癌演进的关系研究较少，且本研究所选取的样本量较少，因此本研究结果还需后续研究进一步证实，以期望为临床上膀胱癌的诊治提供研究新方向。

综上所述，本研究发现PAK6在膀胱癌组织中低表达，ZNF217、GPR48在膀胱癌组织中高表达，与患者分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度、复发相关，参与膀胱癌的演进。