老年骨质疏松患者血清miR-155-5p表达变化及意义

唐旭， 陈健， 谢凯△

1宁波大学医学院附属医院康复科(浙江宁波 315020)； 2宁波市医学科学研究所医学分子诊断中心(浙江宁波 315020)

骨质疏松(osteoporosis, OP)是一种好发于老年人的代谢性骨病，易引发骨折，引起肢体畸形，使患者活动受限，对患者正常生活构成不良影响[1-2]。积极寻找与OP发病相关因素，给予适当干预，甚是重要。目前，研究认为，OP病理变化与微小RNA(microRNA, miRNA)异常表达、骨代谢异常、炎症反应、激素异常分泌等相关[3-4]。研究显示，微小RNA-155-5p(microRNA-155-5p, miR-155-5p)可调控破骨细胞分化[5]；另外，白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是IL-1家族重要成员，主要由巨噬细胞分泌，其可通过旁分泌、自分泌等方式参与免疫调节和炎症反应，而肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是一种Ⅱ型膜蛋白，其作为重要的炎症反应因子，其可参与原发性炎症反应，也可影响继发性炎症反应，与免疫调节、内毒素休克、肿瘤发展等有关，IL-1β、TNF-α均在老年OP患者中呈高水平，两者均可能参与OP发生，测定血清IL-1β、TNF-α水平有助于临床诊治OP，评估患者预后[6]。推测miR-155-5p可能与OP发病相关。基于此，本研究通过测定miR-155-5p在老年OP患者中的表达水平，分析其与IL-1β、TNF-α及骨代谢指标的关系，为临床诊治老年OP提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年8月至2021年1月本院诊治的老年OP患者90例为OP组，其中男39例，女51例，年龄61～82岁，平均(70.83±7.78)岁，体质指数(body mass index, BMI)17.14～24.80 kg/m2，平均(21.24±2.31)kg/m2；吸烟46例。另纳入同期老年体检健康者90例为健康组，其中男44例，女46例，年龄61～82岁，平均(71.02±7.91)岁，BMI为17.06～24.89 kg/m2，平均(21.33±2.35)kg/m2，无严重心、肝、肾、肺等脏器疾病，无OP疾病，近期无炎性疾病；吸烟40例。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

OP诊断标准：依据《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识》[7]OP相关判定标准进行诊断。

纳入标准：(1)患者年龄>60岁，均符合OP诊断标准；(2)临床资料完整；(3)可清晰沟通交流、无认知障碍。

排除标准：(1)合并结缔组织疾病、糖尿病、代谢营养性骨病者；(2)合并心血管系统疾病、肝肾功能不全、甲状腺功能亢进、类风湿关节炎者；(3)合并骨肿瘤或其他肿瘤者；(4)近6个月内使用维生素D、钙剂、糖皮质激素者。

本研究符合《赫尔辛基宣言》，经本院伦理委员会批准，获取受试对象本人或其亲属知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 收集体检健康者及老年OP患者空腹外周血，静置后分离血清(4 600 r/min离心5 min)，分装，于-70℃冰箱保存，备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法检测血清miR-155-5p表达水平 冰上解冻适量血清，加cel-miR-39以校正血清miR-155-5p水平，利用miRNA纯化试剂盒(货号：FuHengT009，上海富衡生物科技有限公司)纯化miRNA，依据TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(货号：4366597，ThermoFisher)说明书获取cDNA，最终，应用TaqManTMUniversal PCR Master Mix(货号：AB-4324018，美国Invitrogen)制备反应体系，加样，在荧光定量PCR仪(型号：StepOneTM，美国ABI)上检测。反应条件设置为：95℃预变性3 min；95℃变性25 s，65℃退火30 s、70℃延伸30 s，40个循环；每个样本重复测3次。其中cel-miR-39引物序列为5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′，miR-155-5p上游引物序列为5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′，下游引物序列为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。以2-ΔCt法计算血清miR-155-5p水平，ΔCt=目的基因Ct值-cel-miR-39 Ct值。

1.2.3 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定血清IL-1β、TNF-α水平 于-20℃冰箱中取出人IL-1β ELISA试剂盒(货号：111010，广州蕊特生物科技有限公司)、人TNF-α ELISA试剂盒(货号：ABE10038，上海瓦兰生物科技有限公司)所携带的标准品，按其说明书将标准品制成不同浓度的IL-1β、TNF-α标准品溶液，于波长450 nm处使用酶标仪(型号：MultiskanFC，赛默飞世尔)测定IL-1β、TNF-α标准品溶液吸光度，绘制两者的标准品回归曲线；将-70℃冰箱中冻存的血清样本取出，室温下解冻，平衡至室温约30 min，将血清加至96孔酶标板中，设3个复孔，每孔100 μL血清；将酶标板置于37℃培养箱中，孵育25～30 min，每孔分别加含有IL-1β/TNF-α的生物素工作液，再次将酶标板放入37℃培养箱中，孵育50～60 min，弃反应液后用磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗2～3次；每孔加100 μL亲和素-过氧化物酶复合物工作液后，酶标板放于37℃培养箱中，恒温孵育25～30 min，弃反应液后用PBS洗2次；每孔加90 μL显色液，37℃培养箱中孵育约25 min，每孔均加10 μL终止液，于波长450 nm处读取血清样本吸光度，结合IL-1β、TNF-α的标准回归方程，计算两者血清水平。

1.2.4 血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽(procollagen Ⅰ type N-terminal peptide, PINP)、β-胶原特殊序列(β-CrossLaps)水平检测 室温解冻血清，应用全自动电化学发光免疫分析仪(cobas 6000e601，罗氏公司)及配套试剂盒测定血清PINP、β-CrossLaps水平。

2 结果

2.1 两组血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平比较 与健康组相比，OP组患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)。见表1。

表1 两组血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平比较

2.2 两组血清PINP、β-CrossLaps水平比较 与健康组相比，OP组患者血清PINP降低(P<0.05)，β-CrossLaps水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 两组血清PINP、β-CrossLaps水平比较

2.3 老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平与PINP、β-CrossLaps水平的相关性 Pearson相关分析显示，老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平与PINP水平均呈负相关(P均<0.05)，与β-CrossLaps水平呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平与PINP、β-CrossLaps水平的相关性

2.4 老年OP患者血清miR-155-5p表达水平与IL-1β、TNF-α水平的相关性 Pearson相关分析显示，老年OP患者血清miR-155-5p表达水平与IL-1β、TNF-α水平均呈正相关(r=0.596、0.565，P均<0.05)。见图1、2。

图1 老年OP患者血清miR-155-5p表达水平与IL-1β水平的相关性

图2 老年OP患者血清miR-155-5p表达水平与TNF-α水平的相关性

2.5 Logistic回归分析影响老年OP发生的影响因素 以miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、PINP、β-CrossLaps为自变量。以老年OP是否发生(发生=1、不发生=0)为因变量，将赋值后的miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、PINP、β-CrossLaps纳入logistic回归分析，结果显示miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps均是影响老年OP发生的危险因素(P<0.05)，PINP是影响老年OP发生的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响老年OP发生的logistic回归分析

3 讨论

骨成熟后，骨组织处于成骨细胞形成新骨与破骨细胞对旧骨吸收的平衡中，任何造成骨形成低于骨吸收的因素均可引起骨量减少、OP的发生[8-9]。因老年人整体功能低下，更易导致骨形成低于骨吸收，进而引发OP[10-11]。近年来，随着人口老龄化日趋严重，OP发生率逐年升高，其易造成骨折，严重影响老年OP患者生活质量，因此，寻找与OP发病相关的指标，及时干预，对改善老年OP患者生存质量有积极意义。

miRNA是存在于血清、血浆、组织液中的一类小RNA分子，其在氧化应激、机体代谢、炎症反应等生物学过程中发挥调控作用，与骨关节炎、OP、骨质增生等疾病进展关系密切[12-15]。既往研究显示，miR-155是miRNA的一员，其可调节免疫应答、炎症反应等过程，而miR-155-5p作为miR-155的重要成员，其在骨关节炎软骨细胞中呈高表达，miR-155-5p可能通过影响NF-κB信号通路，进而影响软骨细胞凋亡、增殖[16]；另外，miR-155-5p下调可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞侵袭及生长，其可作为诊治类风湿关节炎的潜在指标[17-18]。以上研究表明，miR-155-5p可能与骨代谢异常疾病有关。本研究中老年OP患者血清miR-155-5p表达水平高于健康者，提示miR-155-5p可能在老年OP中起作用，推测miR-155-5p高表达可能激活NF-κB信号通路，影响其下游基因表达及骨细胞生长，促进炎症反应，进而影响OP发生发展。NF-κB参与炎症反应、成骨细胞凋亡、分化、增殖过程，影响骨形成与骨吸收，与OP密切相关[19-20]。

IL-1β、TNF-α是NF-κB信号通路的下游基因，两者在OP患者中水平较高，与骨密度相关，经二磷酸盐治疗后，其水平降低，IL-1β、TNF-α可能在OP病变过程中起作用[21]。本研究显示，OP组患者血清IL-1β、TNF-α水平高于健康组，与陈杨畅等[6]研究结果相符，提示OP发生发展可能与IL-1β、TNF-α水平异常有关，分析原因，IL-1β高水平可降低骨细胞活性，减少骨形成，降低骨密度，影响OP病理发展；TNF-α可促进骨吸收，阻断骨基质胶原合成，且其可直接损伤肾血管-基底膜屏障，使血管通透性增高，造成血清蛋白渗漏，打破钙磷代谢平衡，进而引发OP[6]。此外，本研究中老年OP患者血清miR-155-5p表达水平与IL-1β、TNF-α水平均呈正相关，提示miR-155-5p可能通过影响NF-κB信号通路，促进IL-1β、TNF-α表达，促进炎症反应，从而在老年OP中发挥作用，但具体机制仍需深入探究证实。

骨代谢标志物水平可灵敏地反映机体骨骼状态，有助于判定机体是否存在OP。其中，PINP可反映Ⅰ型胶原水平，其水平升高表示Ⅰ型胶原合成速度加快，骨代谢转换活跃，PINP是骨形成的重要指标；而β-CrossLaps是源于骨质中的胶原成分，可作为骨吸收的有效标志物，PINP、β-CrossLaps水平变化可灵敏地反映机体骨代谢水平[22-25]。研究发现，PINP在老年原发性OP中水平较低，经强骨胶囊与鹿瓜多肽注射液联合治疗后，PINP水平升高，其可能是判断老年原发性OP治疗效果的指标[26]；另外，β-CrossLaps在老年原发性OP中水平升高，其可辅助诊治老年原发性OP[27]。以上研究表明，PINP、β-CrossLaps水平异常可能与OP相关。本研究显示，OP组患者血清PINP水平低于健康组，β-CrossLaps水平高于健康组，与相关研究[21-22]趋势一致，且老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平与PINP水平均呈负相关，与β-CrossLaps水平呈正相关，提示老年OP患者存在骨代谢异常，且miR-155-5p、IL-1β、TNF-α可能通过影响骨代谢进而影响OP发生发展。进一步研究显示，miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps均是影响老年OP发生的危险因素，PINP是影响老年OP发生的保护因素，提示血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps水平越高，PINP水平越低，骨代谢失衡越严重，及时监测上述指标，有利于临床及早诊治老年OP。

综上所述，miR-155-5p在老年OP患者中呈高表达，其与IL-1β、TNF-α及骨代谢关系密切，监控miR-155-5p水平可能有助于临床防治老年OP。本研究首次从临床方面确定miR-155-5p在老年OP患者中表达失调，并分析了其与IL-1β、TNF-α及骨代谢指标的相关性，为临床诊治老年OP提供新思路，但后期仍需进一步探究miR-155-5p在老年OP中的作用机制，为临床诊治老年OP增加说服力。