针康法对脑缺血小鼠神经功能及叉头转录因子3和维甲酸相关孤儿受体γt表达的影响

杨赫，唐强，朱路文

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001

缺血性脑卒中是一种可导致运动、感觉、视觉和认知障碍甚至死亡的脑血管病[1]。在临床实践中，各种疗法已被用于脑卒中后康复，如药物治疗、针灸、运动训练和外科手术[2-3]。溶栓疗法是脑卒中后最有效的首选治疗方法[4]。

脑卒中的治疗药物包括组织型纤溶酶原激活剂、依达拉奉、尼莫地平、氯吡格雷、阿司匹林和双嘧达莫等，这些药物由于禁忌证、严重的副作用和狭窄的治疗窗导致患者依从性低，影响生活质量[5]。目前，康复治疗是治疗脑卒中后神经功能缺损的最佳方法[3,6]。除康复治疗外，针灸在临床上也颇受欢迎。脑卒中治疗的最终目标是恢复患者的行为功能[7]，针刺治疗的脑卒中患者表现出比常规治疗更多的行为功能和结构完整性的改善[8]。

针康法是脑梗死和神经功能缺损康复的新策略，即遴选头穴刺激区留针同期运用康复手法专项治疗，体现“针康同步、动态治疗、整体康复”的诊疗思路[9]。前期临床研究[10]和其他报告[11-12]结果表明，针康法是治疗缺血性脑卒中后功能重塑和行为改善安全有效的治疗方法[13]。针康法减轻脑缺血的机制可能与炎症细胞和炎症通路有关[14-15]。纠正辅助性T 细胞17(T helper cell 17,Th17)/调节性T 细胞(regulatory T cells,Tregs)失衡的方法可能是改善缺血性卒中致病的关键因素[16]。Gelderblom 等[17]发现封闭白细胞介素17 (interleukin 17,IL-17)的功能后，脑梗死面积缩小，可以起到脑保护作用。而维甲酸相关孤儿受体γt (retinoic acid-related orphan receptor γt,RORγt)能直接激活编码IL-17A 和IL-17F[18]。根据缺血模型和研究目标选用改良神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)，优点是容易操作，可简单快速地综合评估缺血损伤整体程度。相较于转棒测试、脱胶测试、旷场试验，它敏感性高、测试窗口宽，适合长期观察[19]。

本研究探讨针康法能促进缺血性脑卒中小鼠缺血侧皮质Th17/Treg平衡及改善神经功能的假说。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雌性SPF 级C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量(22.0±3.2)g，购自黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，许可证号SCXK(辽)2015-0001。适应性饲养3 d，实验前筛选适应跑台训练，一般状况正常小鼠纳入研究。实验过程中给予动物充足的食物和饮水。室温(22±2)℃，相对湿度45%～65%，每4 min换气1次，采用12 h/12 h 光照/黑夜循环照明系统。对实验小鼠处理遵循2006年国科委《关于善待实验动物的指导性意见》执行。随机化编码将45 只小鼠分为假手术组、模型组、针刺组、康复组、针康组，每组9 只。在造模术后3 d、7 d、14 d三个时间点每次抓取3只。

所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.2 主要仪器和试剂

ZH-PT 型动物实验跑台：安徽正华生物仪器设备有限公司。洁净工作台：苏州安泰技术有限公司。TS-1000 脱色摇床数显定时：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。TGL16E 台式高速冷冻离心机：长沙英泰仪器有限公司。Western blotting 系统、Chemi-Doc MP 凝胶成像系统：美国BIO-RAD 公司。一次性使用无菌皮内针：苏州针灸用品有限公司。兔抗叉头转录因子3(transcription factor Forkhead box P3,Foxp3)(ab75763)：艾博抗上海贸易有限公司。兔抗ROR Gamma T、兔抗β-actin：北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 模型建立

参照Longa的方法[20]加以改良。术前1 d禁食不禁水，4%水合氯醛0.01 ml/g 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于改良手术台上，颈前部剃毛消毒。钝性分离皮下肌肉、腺泡，显微镜下找到右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，显微血管夹夹闭颈总动脉的近心端，颈总动脉下方备线系活结，6-0 号缝合线于颈内动脉的远心端打一松结，用线阻闭颈外动脉血流。在颈总动脉和颈内动脉两线结间刺一小口，方向朝颈内动脉头端，将已备好线栓缓慢推入，有轻微阻力停止。线栓插入深度约0.8 cm，固定好线栓，线结系死。拉紧颈总动脉打方结，松开显微止血夹，缝合皮肤，术区消毒，单笼保温饲养。假手术组操作不插线栓，术后24 h即进行Longa评分，1～3分可入组。

1.4 干预方法

假手术组和模型组剥夺治疗，只给予同等条件抓取。

针刺组：术后1 d，参考华兴邦等[21]研制的《大鼠针灸穴位图谱》及于氏头穴丛刺针法[22]取穴。用皮筋及医用胶带将模型小鼠固定在手术台上，从前顶至百会方向定位在百会穴及左右各旁开2 mm 处，直径0.22 mm、长5 mm 揿针丛刺4～5 mm，快速提插1 min后留针1 h，之后每天1 次，以3 d、7 d、14 d 为观察时间节点。

康复组：术后1 d，施以电动跑台训练治疗。坡度0°；术后第1～3 天10 m/min，第4～14 天15 m/min；每次30 min，每天1次。以3 d、7 d、14 d为观察时间节点。

针康组：术后1 d，针康组进行针康法治疗。用皮筋及医用胶带将模型小鼠固定在手术台上，头穴丛刺取穴方法参考针刺组。在小鼠头穴丛刺留针过程中同步接受电动跑台训练，每天1 次。跑台训练同康复组设计标准。

1.5 神经功能评定

分别于治疗后3 d、7 d、14 d 进行采用mNSS[23]进行评价。分值越高神经功能缺损程度越重，取两次均值。

1.6 Western blotting

术后3 d、7 d、14 d三个时间点每组分别取3只小鼠，腹腔注射戊巴比妥50 mg/kg 麻醉。断头，离体立刻冰冻5 min 后，-80 ℃保存。割取脑组织冠状位前囟前后各2 mm 放冰盒上称取右侧脑组织质量，液氮研磨，称重约70 mg 匀浆。将这些冷冻组织粉转移到含有RAPI 裂解缓冲液(P0013D，上海Beyotime 公司)的1.5 ml 离心管中冰上裂解，匀浆在4 ℃下12 000 g离心5 min，收集上清液作为总蛋白，整个过程30 min 内完成。蛋白定量根据考马斯亮蓝法用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006，上海Beyotime 公司)对蛋白质样品进行定量，根据标准孔蛋白浓度和吸光度计算标准曲线。12%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移到聚偏氟乙烯膜上。然后用酶促反应发光法直接显色，脱脂牛奶(5%)封闭膜，并在4 ℃下与以下一抗孵育过夜：兔多克隆抗Foxp3 (1∶500)，兔多克隆抗Roγt (1∶500)。洗涤3 次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃下偶联1 h，以β-actin 为内对照。用ECL试剂盒显影免疫条带。

采用Image Lab 软件5.2.1 版本对每个条带的密度进行量化。蛋白表达量=目的条带灰度值/β-actin 条带灰度值。选中一个条带作为对照“1”，选择定量工具比较其余条带，每个泳道的定量结果就会显示出来。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0 进行统计学分析。所有数据均采用()表示，组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)及Tukey 多重比较检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 mNSS

术后各时间点，假手术组mNSS 为0 分，模型组mNSS均高于假手术组(P＜0.05)。术后3 d，与模型组比较，康复组、针康组mNSS 降低(P＜0.05)。术后7 d，与假手术组比较，针刺组mNSS 升高(P＜0.05)。术后14 d，与模型组和针刺组比较，针康组mNSS 降低(P ＜0.05)。见表1。

表1 各组造模后mNSS

2.2 Western blotting

2.2.1 脑组织Foxp3表达

术后3 d，与假手术组、模型组比较，针康组Foxp3 表达量降低(P ＜0.05)。术后7 d，与其他组比较，针康组Foxp3 表达量均降低(P ＜0.05)。术后14 d，与假手术组、模型组比较，针康组Foxp3 表达量降低(P ＜0.05)。见表2、图1。

表2 各组脑Foxp3表达

图1 术后各时间点各组脑组织Foxp3的蛋白表达(Western blotting)

2.2.2 脑组织RORγt表达

术后3 d，与其他组比较，针康组RORγt 表达量增加(P ＜0.05)。术后7 d，与针刺组、假手术组比较，针康组RORγt表达量均增加(P ＜0.05)。术后14 d，与假手术组比较，模型组、针刺组、针康组RORγt表达量均降低(P ＜0.05)；与模型组、针刺组比较，康复组RORγt表达量升高(P ＜0.05)；与康复组比较，针康组RORγt表达量降低(P ＜0.05)。见表3、图2。

图2 术后各时间点各组脑组织RORγt的蛋白表达(Western blotting)

表3 各组小鼠脑RORγt表达

3 讨论

本研究显示，对Th17 细胞形成起着关键作用的RORγt，经过康复训练和针康法治疗7 d 后明显升高，同时，Foxp3 含量明显降低。本研究还显示，针康组可降低脑缺血损伤后3 d、7 d、14 d的mNSS。

脑缺血后脑组织激活适应性免疫并参与卒中慢性期神经修复减轻脑水肿。给予针刺、康复治疗后Foxp3 表达明显受到抑制、RORγt 表达明显增强。且针康组治疗后Foxp3 水平低于单纯针刺或康复训练，7 d 时效果最显著；针康组RORγt 水平明显高于单纯针刺或康复训练，3 d、7 d 效果最显著，14 d 时，针康组RORγt 表达减少。关于病灶侧Foxp3、RORγt 蛋白改变的机制如下。①Foxp3、RORγt 蛋白的驱动因素尚不明确，IL-6、STAT 3 和TGF-β 信号通路可共同促进RORγt 的表达[24]。针康法能同时激活IL-6、IL-10促进免疫细胞集聚[25]，促进Tregs 中RORγt 的表达，诱导Foxp 3分化[26]。②Tregs通过淋巴细胞功能相关抗原-1/细胞间黏附分子-1 (lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1/intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)途径增加血小板与缺血脑内皮细胞的黏附性，导致脑缺血后微血管功能障碍[27]。针康法可改善缺血后血管内皮损伤，促进血管再生[28]。③星形胶质细胞活化异常触发T 细胞免疫反应，上调炎症因子作用[29]。针刺、康复、针康法干预均能抑制脑缺血后星形胶质细胞的活化[30]，降低Th17细胞表达[31]。

本研究观察了一系列与脑卒中后神经炎症有关的组织化学反应，这些结果还需在随后的研究中加以扩展，并加入小鼠的脑血流监测及增加炎性因子指标。

综上所述，针康法治疗可进一步改善脑缺血小鼠功能结果，限制脑损伤，可能与调节Foxp3、RORγt表达有关。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。