兴义维蚋幼虫扭动摄食方式的神经-肌肉结构基础

张洪卫，高 晗，寻 慧，杨 明

(贵州医科大学基础医学院，生物学系暨医学昆虫重点实验室，贵阳 550025)

蚋类(black flies)幼虫为河流的清洁者，有助于水质净化(Wotton, 2010)，可作为水污染的指标(Kupryianchyketal., 2018)。这与幼虫在流水中独特的运动模式及取食方式有关。蚋类隶属于双翅目Diptera蚋科Simuliidae，呈世界性分布，为完全变态发育昆虫，其生活史包括水生期和陆生期，历经卵、幼虫、蛹及成虫4个阶段(陈汉彬等，2016)。蚋幼虫在流水中生活发育，先依靠口器吐出细丝在水生植物或岩石等附着物上形成丝垫，再凭借腹部末端的后环(posterior circlet)钩刺挂在附着物上，靠摆动和屈伸体躯进行运动。蚋幼虫身体屈伸时可形成拱桥形状，似尺蠖式蠕动爬行(Reidelbach and Kiel, 1990)。身体摆动时可扭动180°进行滤食(陈汉彬等，2016)，能摄取直径300 μm以内的细菌、单细胞藻类和浮游生物等食物颗粒(Wotton, 1976 , 1980)。昆虫所有的运动、感觉及生理过程都会受到神经系统和激素的联合控制(Gullan and Cranston, 2014)，研究蚋幼虫的腹神经索及周围神经与肌肉之间的连接结构有利于昆虫生长发育和行为学运动方式的研究(Gullan and Cranston, 2014)。

迄今对蚋幼虫腹神经索结构的研究仅见两例。Puri(1925)在解剖学基础上阐述了蚋幼虫神经系统的组成及肌肉的分布模式。寻慧等(2013)利用组织学方法研究兴义维蚋Simuliumxingyiense幼虫的中枢神经系统，并阐述了幼虫中枢神经系统和腹神经索结构的基本构成。尚未见对神经节的精细结构及神经索周围神经分支与肌肉间连接结构的研究。因此，本文在前人研究基础上，通过应用免疫荧光技术和图像信息采集技术研究兴义维蚋腹神经索组成、神经节内部的细微结构、相邻神经节之间的周围神经连接结构及神经分支与肌肉连接的结构基础。

抗辣根过氧化物酶(anti-horseradish peroxidase，anti-HRP)抗体可特异性识别和结合神经细胞膜上的岩藻糖蛋白(Jan and Jan, 1982)，对果蝇Drosophilidae神经组织特异性染色，通过显色可定位神经组织以探明各路神经分支走向(Katzetal., 1988, Wangetal., 1994)。anti-HRP还应用于其他昆虫的神经系统发育研究，包括蝗虫(Snowetal., 1987)、蚊(Kwonetal., 2016)、蜜蜂(Farooquietal., 2003)等。本文以兴义维蚋成熟幼虫为研究对象，使用anti-HRP抗体和phalloidin对幼虫进行免疫荧光染色(Brentetal., 2009a , 2009b)，通过激光扫描共聚焦显微镜对幼虫腹神经索及周围神经与肌肉连接的结构基础进行可视化研究。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

蚋类幼虫于2018年10～12月采自贵州省贵阳市青岩古镇龙井村(26.335787°N，106.672846°E)，投入本实验室的蚋类饲养系统进行饲养(贾若等，2018)。在NIKON SMZ18体视显微镜下，根据形态学特征鉴定兴义维蚋成熟幼虫(陈汉彬等，2016)。

1.2 腹神经索解剖

兴义维蚋幼虫腹神经索的解剖主要参考果蝇的方法(Brentetal., 2009a)。将幼虫放入硅胶皿中，用磷酸盐缓冲液(1×PBS，pH7.3)淹没虫体，使其背面朝上，以解剖针(0.01 mm，Austerlitz)固定住幼虫头尾(图1-A)。再用眼科剪沿背部中线剪开体壁暴露体腔，用镊子小心去除体内的脂肪、气管、唾液腺、消化道及马氏管，并展开幼虫皮层(图1-B)。整个解剖过程要求在20 min内完成，且操作过程应轻微。在NIKON SMZ18体视显微镜下进行形态学观察和拍照。

图1 兴义维蚋幼虫解剖图解Fig.1 Dissection of Simulium xingyiense larvae注：A，固定幼虫头部和尾部(箭头)；B，腹神经索。方位：A，前向；D，背向；L，侧向；P，后向； V，腹向。标尺为200 μm。Note: A, Fixed head and tail of larva (arrow); B, Ventral nerve cord. Direction: A, Anterior; D, Dorsal; L, Lateral; P, Posterior; V, Ventral. Scale bars, 200μm.

1.3 免疫染色

兴义维蚋腹神经索的免疫荧光染色主要参考果蝇的方法(Brentetal., 2009b)。将虫体解剖后，吸出PBS，加入固定液(4%多聚甲醛，pH7.4)室温固定30～35 min，移去固定液，用含有0.3%Triton的PBS(PBST)冲洗；快洗2次，慢洗1次(15 min)。用现配的封闭液室温封闭30 min；[封闭液配方：PBST中加入5%胎牛血清(四季青11011-8611)]。弃封闭液，加入一抗孵育液(1 ∶200 Rabbit anti-HRP，Jackson immunoresearch)于4℃冰箱孵育过夜；弃一抗孵育液，PBST快洗3次，慢洗3次(每次15 min)。再用封闭液室温封闭30 min。弃封闭液，加入二抗孵育液(1 ∶200 cy5、1 ∶200 phalloidin，Jackson immunoresearch)于4℃冰箱避光孵育过夜；弃二抗孵育液，PBST快洗3次，慢洗2次(每次15 min)。加入Hoechst核染液(1 ∶1000 Hoechst 33342，Thermo Fisher)室温染色15 min，PBST洗涤15 min。在体视镜下去除细小杂物，将虫体转移至滴有GD(2.2% DABCO，Sigma-Aldridge，USA；70%甘油；1×PBS)的载玻片上，盖上盖玻片，用指甲油封片，干燥后置4℃冰箱避光保存。

1.4 激光共聚焦显微成像及图像处理

用激光扫描共聚焦显微镜(日本，Olympus FV1000)观察，对Cy5型染料采用635 nm的激发波长进行激发，显示白色；FITC型染料采用488 nm的激发波长进行激发，显示绿色；Hoechst型染料采用405 nm的激发波长进行激发，显示蓝色。采集图片，图像分辨率为1 024×1 024。用Adobe Photoshop CS6处理图像。

2 结果与分析

2.1 腹神经索结构

兴义维蚋幼虫腹神经索由11对神经节及连接的神经索组成，包括胸神经节3对及腹神经节8对。胸神经节包括前胸神经节(prothoracic ganglion，proTG)、中胸神经节(mesothoracic ganglion，mesoTG)和后胸神经节(metathoracic ganglion，metaTG)，分别位于第1至第3胸节内。1～5腹神经节(abdominal ganglions 1～5, AG 1～AG 5)分别位于第1至第5腹节内，6～8腹神经节(abdominal ganglions 6～8, AG 6～AG 8)几乎融合，位于第6腹节内。3对胸神经节和AG 6～AG 8呈圆形，AG 1～AG 5呈长椭圆形。从proTG至AG 8，神经节逐渐变小，proTG直径约为AG 8的4倍。以metaTG的直径(记为Φ)为基准，从proTG到AG 8，连接神经节之间的神经索长度依次约为Φ的0.6、0.6、0.6、2.0、2.3、2.1、1.9、0.7、0、0倍(图2-A)。

mesoTG后端背侧存在一对横神经(transverse nerve，TN)伸向两侧腹肌内；AG 1后端背侧、AG 2前端背侧、AG 3前端背侧、AG 4后端背侧和AG 5后端背侧都存在类似结构(图2-C)。相邻的横神经两侧由2条纵神经(longitudinal nerve，LN)连接(图2-C)。

2.2 腹神经索周围肌肉结构

幼虫腹部的肌肉分为横肌、纵肌及斜肌3类肌群，腹神经索的两侧肌肉几乎对称排列，由外层至底层依次可见纵肌、斜肌、纵肌和横肌(图2-B)。

2.3 体神经节结构

每对体神经节的结构相似。幼虫神经节仍保留两神经管融合形成的特征，并未完全融合成一个神经节(图3-A)。每对神经节由左右两团神经胞体聚合而成，细胞核主要聚集在两侧及中线处，呈无头无尾的Φ形(图3-A)。中线处排列两层神经细胞核，将神经髓分为两室，也有部分细胞核游离入神经髓内。神经节与神经索连接处的细胞核较少。神经节外围由单层扁平鞘细胞包裹(图3-A，箭头)，其表面存在粗细不等的神经分支(图3-B，三角)。

图2 兴义维蚋幼虫腹神经索周围的神经和肌肉整体结构Fig.2 Integral structure of nerves and muscles around ventral nerve cord of Simulium xingyiense larvae注：A，腹神经索结构组成(Hoechst染色；proTG，前胸神经节；mesoTG，中胸神经节；metaTG，后胸神经节；AG 1～AG 8，第1～8腹神经节)。B，腹肌分横肌、纵肌及斜肌，腹肌由外层至底层依次可见纵肌、斜肌、纵肌及横肌(phalloidin染色)。C，腹神经索背侧神经的连接结构(anti-HRP染色；横神经TN；纵神经LN)。D，神经分支延伸入肌肉层。方位：A，前向；L，侧向；P，后向。图A、B、C、D均分别为3张激光扫描共聚焦显微照片拼接而成。标尺为300 μm。Note: A, Structural composition of ventral nerve cord (Hoechst staining; proTG, prothoracic ganglion; mesoTG, mesothoracic ganglion; metaTG, metathoracic ganglion; AG 1 to AG 8, abdominal ganglia 1～8). B, Abdominal muscles were divided into transverse muscles, longitudinal muscles and oblique muscles; There were longitudinal muscles, oblique muscles, longitudinal muscles and transverse muscles from outer to bottom layer (phalloidin staining). C, Structure of nerve onnection on dorsal side of ventral nerve cord (anti-HRP staining; transverse nerve TN; longitudinal nerve LN). D, Nerve branches extended into the abdominal muscle. Figure A, B, C and D were spliced from three laser confocal scanning photoes respectively. Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. Scale bars, 300 μm.

图3 兴义维蚋幼虫体神经节及神经分支结构Fig. 3 Structures of somatic ganglia and nerve branches of Simulium xingyiense larvae注：A，神经细胞核排列呈无头无尾的Φ形(Hoechst染色)；B，神经节外围的扁平鞘细胞和表面的神经分支(扁平鞘细胞，箭头；神经分支，三角)。方位：A，前向；L，侧向；P，后向。标尺为50 μm。Note: A, Nerve nucleus were arranged in a headless and tailless Φ shape (Hoechst staining). B, Flat sheath cells surrounding the ganglion and various thicknesses nerve branches on the surface of ganglia (Flat sheath cells, arrows; Nerve branches, triangle). Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. Scale bars, 50 μm.

2.4 1～6腹节内神经分支和肌肉的连接结构

1～5腹节可见TN与LN相连，呈梯形连接结构(图4-A)。TN伸入神经索两侧的腹纵肌内，由之分出的神经末梢呈链珠状膨出的终扣结构(图4-B)。AG 7和AG 8后端分别发出2条和4条侧神经伸入体腔，AG 8发出的4条侧神经交叉伸出(图4-C)。

AG 1～AG 5中部发出两对侧神经(N 1、N 2)分别伸入两侧腹肌，N 1沿腹肌伸至背纵肌(图4-D)。N 2伸入腹纵肌，在两纵肌中间点穿出后，伸出的神经末梢呈链珠状终扣结构(图4-E)，观察发现神经末梢均通过此结构与肌肉连接。N 1穿过腹肌至背纵肌，又分出两支神经(N 3、N 4)，N 3指向背中缝，N 4沿肌肉层又分出下级神经分支(图4-F)。

1～5腹节各有一组翼肌牵拉背血管，每侧翼肌分为前后两支，翼肌从悬着点发出后形成一个夹角(图4-G，箭头)。在该夹角区靠背血管处可见两群心周肾细胞(pericardial nephrocyte)(图4-H)。N 3沿翼肌伸入肾细胞群，神经可走行于前侧翼肌，也可走行于后侧翼肌，还可分两支后沿两翼肌进入肾细胞群(图4-C，E)。

3 结论与讨论

兴义维蚋成熟幼虫的腹神经索可见11对神经节，即胸部3对和腹部8对，为完全变态昆虫幼虫的典型特征，与前人在解剖学和组织学上的研究报道结果相同。不同物种，幼虫神经节的融合程度不同，兴义维蚋与同为双翅目长角亚目的蚊类相似。幽蚊Chaoborus幼虫的AG 6分离，AG 7和AG 8发生融合(Wohlfrom and Melzer, 2001)；摇蚊Chironomidae幼虫的后胸神经节与第2腹神经节发生融合，其余未融合(Meyersetal., 2015)；家蝇Muscadomestica幼虫的胸神经节和腹神经节全部融合成一个胸神经节(Wanninger and Andreas, 2015)。果蝇Drosophliamelanogaster幼虫的胸神经节和腹神经节均完全融合，整合了腹神经索(Wanninger and Andreas, 2015)。兴义维蚋幼虫的最后3个腹神经节发生融合，而未完全合并。

兴义维蚋幼虫腹神经索的神经节分出两对神经分别伸入两侧肌肉，其背侧存在横神经支配肌肉运动，这与Puri的解剖学结果一致。但Puri发现神经节的正中神经与横神经连接成三角神经丛，本研究未出现该结构，可能与研究方法不同有关(Puri, 1925)。本文阐述了在第1～5腹神经节两侧，两条纵神经连接横神经呈“梯形连接结构”，与前人研究结果不同，可能是在组织学和解剖学基础上较难观察(Puri, 1925；寻慧等，2013)。幼虫腹部共分8节，第1至第4腹节较细，第5腹节处腹部开始膨大，第6和第7腹节的周长最大，第8腹节显著变小(寻慧等，2013)。在第6腹节内的AG 7和AG 8后端分别发出两对侧神经伸入体腔内，AG 7分出一对神经支配第7腹节；AG 8分出两对神经支配第7和第8腹节，内侧一对神经支配第8腹节的后环发挥附着作用(Puri, 1925)。

果蝇幼虫的所有神经节完全融合，其运动神经元通过节段神经、节间神经和横神经3种途径在中枢神经系统中发挥作用。节段神经支配外侧肌和腹侧肌，节间神经支配背侧肌和腹侧肌，共同协调支配肌肉运动(Menonetal., 2013)。天蚕Lepidopterasaturniidae幼虫的神经节外周神经与兴义维蚋具有相似性，都存在横神经，神经节发出的背神经和腹神经共同调控体壁肌肉的运动(Libby, 1959)。

蝗虫的腹神经节参与呼吸、循环、生殖、后肠蠕动、腹部运动和发育过程的调控(Nassel, 1996)。兴义维蚋前胸神经节位于前腹足下方且支配前腹足运动，前3个胸节间存在斜肌，控制胸节运动。第1至第5腹神经节的腹侧和背侧神经控制着体壁肌肉；从胸节至第8腹神经节，相邻体节间存在斜肌，且两斜肌间的间隙逐渐变大，这可能调控着幼虫体躯不同的摆动和屈伸方式。此外，最后3个腹神经节融合，这可能与后腹部的功能简化有关；第8腹节是肛鳃和后环的所在位置，该神经节发生融合可能是为了帮助幼虫的后环完成附着功能。

图4 兴义维蚋幼虫神经节分出的神经与肌肉连接结构Fig.4 Structure of nerve-muscle connection of Simulium xingyiense larvae注：A，横神经(TN，箭头)及纵神经(LN，三角)的连接结构；B，TN伸入神经节两侧腹纵肌内(箭头)，分出的下级神经分支呈链珠状膨出的终扣结构；C，AG 7和AG 8后端分别分出2条和4条侧神经入体腔；D，神经节中部发出两对侧神经(N 1、N 2)伸入肌肉层，N 1沿腹肌伸至背纵肌处，N 2伸入腹纵肌；E，神经末梢呈链珠状终扣结构；F，侧神经(N 1)穿过腹肌至纵肌分出两支神经(N 3、N 4)；G，翼肌，分前后两支(箭头)；H，翼肌牵拉背血管(DV)；在翼肌与背血管连接处排列两列肾细胞群(箭头)，N 3神经分支沿翼肌伸入肾细胞群。方位：A，前向；L，侧向；P，后向。B标尺为50 μm，其余标尺为200 μm。Note: A,Connection structure of the transverse nerves (TN, arrows) and longitudinal nerves (LN, triangles). B, TN extended into the abdominal longitudinal muscles on both sides of ganglion (arrows), and the small nerve branches showed a chain bead-like bulging terminal button structure in abdominal muscles layer. C, There were two and four lateral nerves respectively extended into the body cavity in AG 7 and AG 8. D, Two lateral nerves (N 1, N 2) extended into the muscles layer at the middle bottom of the ganglion, N 1 extended into the drosal longitudinal muscle along abdominal muscles, and N 2 extended into the abdominal longitudinal muscle. E, Protruding nerve endings showed a chain bead-like terminal boutons structure. F, Lateral nerve (N 1) divided two nerve branches when passed through the abdominal muscles to longitudinal muscles (N 3, N 4). G, Alary muscle, divided anterior and posterior branches (arrows). H, Dorsal vessels (DV) were pulled alary muscle. There were two rows of nephrocytes groups (arrows) at the junction of alary muscle and the dorsal vessel. Direction: A, Anterior; L, Lateral; P, Posterior. B: bar=50 μm； Rest bar=200 μm.

本研究首次发现了蚋类的肾细胞与神经纤维存在连接。以往报道肾细胞分食管周肾细胞(perioesophageal nephrocyte)和心周肾细胞两类(Psathakietal., 2018)；食管周肾细胞位于头部，由神经纤维连接，而心周肾细胞和神经纤维的连接未见报道。本研究表明anti-HRP可特异性识别兴义维蚋幼虫的神经组织和肾细胞，并阐述了兴义维蚋幼虫神经节的细微结构及周围神经分支与肌肉连接的结构基础，可为后续进一步研究蚋科昆虫运动的神经机制提供基础(Yeatesetal., 2002)。