祛风地黄汤对银屑病模型小鼠皮损的改善作用*

夏立君，张彦波

（河北省衡水市中医医院，河北 衡水 053000）

银屑病是以红斑、鳞屑、浸润为主要特征的常见慢性炎性皮肤病，发病率高，病程长，且呈周期性反复发作，严重影响患者的生活质量［1］。现代医学对于该病尚无特效治疗方法，西医内服、外用药及物理疗法均有一定不良反应，且停药后易复发，远期疗效较差［2］。中药复方治疗本病副作用小，且能有效降低复发率，缩短病程［3］。祛风地黄汤对治疗寻常型银屑病疗效良好，但其作用机制的研究尚未见报道［4］。银屑病发病机制涉及遗传、环境、内分泌、免疫异常等多种因素，其中辅助性T 细胞17（Th17）／调节性T 细胞（Treg）平衡失调引起的免疫功能异常为重要原因［5］。本研究中以咪喹莫特复制银屑病小鼠模型，以祛风地黄汤灌胃，观察对小鼠皮损的改善作用，并探讨其通过调节Th17／Treg 细胞免疫平衡而发挥作用的可能机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

仪器：EG1160 型石蜡包埋机、2135 型组织切片机（德国Leica 公司）；CX23 型光学显微镜（日本Olympus公司）；GENion Plus 型功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；Mirofuge 20 R 型低温高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；165-8001 型凝胶电泳仪、1652100 型电转仪（美国Bio-Rad 公司）。

药品、试剂、饮片：甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂，批号为026160674，规格为每片2.5 mg）；咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，批号为190706，规格为每支3 g；凡士林（济宁百川化工有限公司，批号为200124）；肿瘤坏死因子-β（TNF-β）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（深圳达科为生物技术有限公司，批 号 分 别 为 20191023，20190921，20190915，20191018）；增殖细胞核抗原（PCNA）及CD3+抗体试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为AE90282Ra，AE99106Ra）；一 抗 孤 独 核 受 体 γt（RORγt），Foxp3（美国CST 公司，批号分别为185632，185921）。生地（批号为200302）、熟地（批号为200219）、白蒺藜（批号为200206）、知母（批号为200118）、黄柏（批号为200311）、独活（批号为200210）、枸杞子（批号为2003008）、菟丝子（批号为2001250）、川牛膝（批号为200207）饮片均购自衡水市医药药材有限公司。

动物：SPF 级BALB／c 小鼠60 只，雌性，6 周龄，体质量18～22 g，购于河北中旭检验检测技术有限公司，动物实验合格证号SYXK（冀）2020-009。饲养于SPF级实验动物房中。经医院实验动物伦理委员会批准，并遵守实验动物饲养和使用原则。

1.2 方法

复制模型与分组给药：将60 只小鼠随机分为空白对照组（等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）、甲氨蝶呤组（1 mg／kg），以及祛风地黄汤低、中、高剂量组（8.76，17.55，35.10 g／kg），各10 只。小鼠背部剃毛，形成约2 cm×2 cm 大小的裸露区域，空白对照组小鼠每日定时涂抹等量凡士林42 mg；其余各组小鼠涂抹5%咪喹莫特乳膏42 mg，每日1 次，连续8 d，以复制银屑病小鼠模型。涂抹1 h 后，各组小鼠灌胃相应药物或等体积0.9%氯化钠溶液（0.1 mL／10 g），连续8 d。

银屑病皮损面积及严重程度指数（PASI）：每日观察并拍照记录各组小鼠的皮损变化，参照PASI 评分标准［6］对模型小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润增厚程度进行评分，无为0 分，轻度为1 分，中度为2 分，重度为3 分，极重度为4 分，统计3 项积分总和。

组织病理学观察：于小鼠眼球取血，并处死，取部分背部皮肤组织，以多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，作5 μm 切片，苏木素-伊红（HE）染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察皮损组织病理形态并拍照。

血清TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平测定：于小鼠眼球取血，离心，分离血清，按试剂盒说明书操作。样品孔加入待检血清10 μL，稀释液40 μL，抗体100 μL，于37 ℃恒温箱中孵育1 h，洗涤剂洗板5 次，加入底物液100 μL，37 ℃孵育15 min，显色，各孔加入终止液50 μL，酶标仪检测吸光度（OD）值。以标准物的浓度为横坐标、OD 值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品OD值，由标准曲线查出相应浓度，求相应含量。

PCNA 和CD3阳性表达测定：采用免疫组织化学法。取小鼠背部皮损组织于4%甲醛溶液中固定24 h，经乙醇脱水，二甲苯透明，作5 μm 石蜡切片。切片经脱蜡，透明，脱水后，以过氧化氢孵育20 min，抗原热修复，BSA 封闭20 min，一抗4 ℃条件下过夜，二抗37 ℃条件下孵育20 min，SABC 37 ℃条件下孵育20 min，DAB 显色后封片，光学显微镜下观察拍照，每例标本随机选取5 个视野计数PCNA 和CD3的阳性细胞表达数。

RORγt 和Foxp3 蛋白表达测定：采用Western blot法。取小鼠背部皮损组织，匀浆后加入RIPA 裂解液提取总蛋白，以BCA 法测定蛋白含量。取10 μL 蛋白样品上样，转膜，室温封闭2 h，加入一抗（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST 清洗3 次，加入二抗（1 ∶5 000），室温孵育2 h，回收二抗，TBST 清洗3 次，以显色剂显影。Image J 软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0 统计学软件分析。计量资料以X±s 表示，行单因素方差分析。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠皮损情况

空白对照组小鼠皮肤平坦光滑，无红斑、鳞屑及增厚改变。模型组小鼠皮肤褶皱，皮损处可见明显鳞屑、红斑、皮肤增厚隆起的银屑病样改变。甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠的皮损症状明显减轻，红斑逐渐消退，鳞屑脱落，皮肤增厚减退，皮损症状改善情况随着祛风地黄汤给药剂量的增大而更加明显。与空白对照组比较，模型组小鼠PASI 评分显著升高（P ＜0.01）；与模型组比较，甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠PASI 评分均显著降低（P ＜0.01）。详见图1。

2.2 小鼠皮损组织病理学

a.空白对照组 b.模型组 c.甲氨蝶呤组 d.祛风地黄汤低剂量组 e.祛风地黄汤中剂量组 f.祛风地黄汤高剂量组A.皮损图片 B.统计数据注：与空白对照组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01。下图、下表同。图1 各组小鼠背部皮损变化及PASI 评分a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction medium-dose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Skin lesion pictures B.Statistical dataNote：Compared with those in the blank control group，**P ＜0.01；compared with those in the model group，＃P ＜0.05，＃＃P ＜0.01，as well as the following figures and tables.Fig.1 Changes of back skin lesions and PASI score of mice in each group

a.空白对照组 b.模型组 c.甲氨蝶呤组 d.祛风地黄汤低剂量组 e.祛风地黄汤中剂量组 f.祛风地黄汤高剂量组图2 各组小鼠皮损组织病理学观察（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupFig.2 Histopathological observation of skin lesions of mice in each group（HE，×200）

空白对照组小鼠皮肤组织的表皮层薄，细胞浸润少。模型组小鼠表皮细胞层明显增厚，真皮层可见大量炎性细胞浸润，皮损组织呈银屑病样改变。甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠皮损表皮层较模型组平整，增厚减小，真皮层炎性细胞浸润明显减少。详见图2。

2.3 小鼠血清炎性因子水平

与空白对照组比较，模型组小鼠血清中TNF-β 和IL-10 水平均显著降低，IL-17 和IL-6 水平均显著升高（P ＜0.01）；与模型组比较，甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠血清中TNF-β 和IL-10 水平均显著升高，IL-17 和IL-6 水平均显著降低（P ＜0.05，P ＜0.01）。详见表1。

表1 各组小鼠血清中TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平比较（± s，ng／mL，n ＝10）Tab.1 Comparison of serum TNF-β，IL-10，IL-17 and IL-6 levels in each group（± s，ng／mL，n ＝10）

表1 各组小鼠血清中TNF-β，IL-10，IL-17，IL-6 水平比较（± s，ng／mL，n ＝10）Tab.1 Comparison of serum TNF-β，IL-10，IL-17 and IL-6 levels in each group（± s，ng／mL，n ＝10）

2.4 小鼠皮损组织PCNA 表达水平

空白对照组小鼠表皮层较薄，基底层可见PCNA 阳性表达细胞，呈线性分布。与空白对照组比较，模型组小鼠皮损组织的表皮着色细胞层数显著增加，阳性细胞广泛分布于表皮层，阳性细胞数显著增多（P ＜0.01）；与模型组比较，甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠皮损组织的表皮着色细胞层数较模型组显著减少，阳性细胞多分布于基底层，阳性细胞数显著减少（P ＜0.01）。详见图3。

2.5 小鼠皮损组织CD3+表达水平

空白对照组小鼠皮肤的真皮层可见少量CD3+细胞零星分布。与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤的真皮层CD3+表达水平显著升高（P ＜0.01）；与模型组比较，甲氨蝶呤组及祛风地黄汤中、高剂量组小鼠皮肤的真皮层CD3+表达水平显著降低（P ＜0.01，P ＜0.05）。详见图4。

2.6 小鼠皮损组织RORγt 和Foxp3 蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组小鼠皮损组织中RORγt蛋白表达水平显著升高，Foxp3 蛋白表达水平显著降低（P ＜0.01）；与模型组比较，甲氨蝶呤组及祛风地黄汤低、中、高剂量组小鼠皮损组织中RORγt 蛋白表达水平均显著降低（P ＜0.01），Foxp3 蛋白表达水平均显著升高（P ＜0.01）。详见图5。

3 讨论

a.空白对照组 b.模型组 c.甲氨蝶呤组 d.祛风地黄汤低剂量组 e.祛风地黄汤中剂量组 f.祛风地黄汤高剂量组A.PCNA 表达 B.统计数据图3 各组小鼠皮损组织中PCNA 的表达（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Expression of PCNA B.Statistical dataFig.3 Expression of PCNA in skin lesions of mice in each group（HE，×200）

a.空白对照组 b.模型组 c.甲氨蝶呤组 d.祛风地黄汤低剂量组 e.祛风地黄汤中剂量组 f.祛风地黄汤高剂量组A.CD3+表达 B.统计数据图4 各组小鼠皮损组织中CD3+的表达（HE，×200）a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction medium-dose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Expression of CD3+ B.Statstical dataFig.4 Expression of CD3+ in skin lesions of mice in each group（HE，×200）

a.空白对照组 b.模型组 c.甲氨蝶呤组 d.祛风地黄汤低剂量组 e.祛风地黄汤中剂量组 f.祛风地黄汤高剂量组A.电泳图 B，C.统计数据图5 小鼠皮损组织中RORγt 和Foxp3 的蛋白表达a.blank control group b.model group c.methotrexate group d.Qufeng Dihuang Decoction low-dose group e.Qufeng Dihuang Decoction mediumdose group f.Qufeng Dihuang Decoction high-dose groupA.Electrophoretic chart B，C.Statistical dataFig.5 Expression of RORγt and Foxp3 protein in skin lesions of mice

银屑病在全球的发病率为2%～3%，且有逐年上升趋势［7］。该病多以对症治疗控制复发为主，如用卡泊三醇、维A 酸、糖皮质激素类等外用软膏，内服抗生素、免疫抑制剂等内用药，以及光化学疗法、水疗法等物理疗法进行治疗［8］。银屑病需长期治疗，而各种疗法都有一定程度的不良反应，且停药后易复发，远期疗效较差［2］。中药复方治疗本病能有效降低复发率，缩短病程，其具体机制亟待进一步探究［3］。银屑病发病机制复杂，其中免疫细胞的分化异常是关键［9］，而Th17 及Treg 免疫功能失调是近年来的研究热点。Th17 和Treg 细胞均属CD4+T 淋巴细胞亚群，二者关系密切，功能上相互制约，在正常机体中保持动态平衡状态［10］。银屑病患者外周血及皮损区存在Th17 型细胞因子的过度活化，同时Treg 细胞的活性及功能受到抑制［11］。Th17 所分泌的IL-17 和IL-6 等促炎因子能放大炎性反应，促进银屑病局部皮损的炎性浸润［12］。Treg 能通过表达IL-10、TNF-β 等抑炎细胞因子发挥免疫调节功能，抑制T 细胞的增殖分化，减轻过度免疫及炎性反应［13］。RORγt 和Foxp3 为Th17 和Treg 细胞分化的特异性转录因子，其表达能直接反映Th17 与Treg 细胞的功能与活性［14］。RORγt 的过度表达可诱导炎症产生，Foxp3 是Treg 细胞发挥免疫调节功能的重要蛋白，二者比例的失调与Th17／Treg 细胞失衡密切相关。当RORγt 表达水平持续上升、Foxp3 表达水平不断下降时，最终导致Treg ／Th17 细胞免疫失衡，使皮肤炎症进一步加重，成为皮损反复迁延的关键环节［15］。

咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型所产生的皮损形态、组织病理学变化及免疫细胞因子表达等均与人类银屑病极相似，是国内外公认的银屑病研究动物模型［18］。本研究结果显示，祛风地黄汤能明显改善小鼠的皮损症状及PASI 评分，减轻皮损组织表皮层增厚及真皮层炎性细胞浸润程度，角质细胞异常增殖与活化是引起银屑病表皮增厚的主要原因，PCNA 是反映皮损组织细胞增殖活跃程度的指标［19］。免疫组化结果可见，经祛风地黄汤治疗后，小鼠皮损组织中PCNA 的阳性细胞数较模型组显著减少，多分布于基底层，提示祛风地黄汤能抑制银屑病模型小鼠表皮细胞的增殖分化。真皮层T 淋巴细胞浸润及其免疫功能异常是银屑病的重要特征［20］，祛风地黄汤各剂量组小鼠真皮层CD3+T 阳性细胞数较模型组显著减少，表明祛风地黄汤能抑制T 细胞过度增殖，减轻真皮层T 细胞浸润，从而改善皮肤免疫反应，缓解小鼠皮损症状。ELISA 及Western blot 试验结果显示，祛风地黄汤能有效降低模型小鼠血清中IL-17 和IL-6水平，升高TNF-β 和IL-10 水平，同时下调小鼠皮损组织中RORγt 蛋白的表达，上调Foxp3 蛋白的表达，提示祛风地黄汤可能通过降低Th17 细胞因子和RORγt的表达，同时恢复Treg 细胞活性及其功能蛋白Foxp3的表达，从而抑制T 细胞向Th17 型细胞分化，纠正Th17／Treg 细胞免疫失衡，发挥对模型小鼠皮损的改善作用。

综上所述，祛风地黄汤对模型小鼠银屑病样皮损具有明显的改善作用，其机制可能与调节Th17／Treg 免疫失衡有关。