八珍汤治疗胃癌的网络药理学作用机制*

赵培西，唐仕浩，赵 华，赵 斌，张 艳，杨铁林，郭 燕△，张一力

（1.陕西省肿瘤医院，陕西 西安 710061；2.西安交通大学生命科学与技术学院·生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西 西安 710049）

胃癌是全球第五大癌症，每年超100 万患者确诊［1］。东亚是胃癌患者集中的地区之一［2］。胃癌的治疗以手术为主，术后或不适合手术的患者也可采用药物治疗，对胃癌有效的化学治疗（简称化疗）药物包括氟嘧啶类、铂类、紫杉烷类和伊立替康［2］。但西药常伴各种药品不良反应，如卡培他滨会导致手足综合征［3］，奥沙利铂与精神类疾病和腹泻相关［4］。中药具有抑制癌细胞增殖或诱导其凋亡的作用［5-7］，且药性温和，药品不良反应较少，逐渐受到大众重视。八珍汤别名八珍散，载于多本医方著作，其由人参、白术、白茯苓、当归、川芎、白芍、熟地黄、甘草组方，对胃癌有一定疗效［8-10］，但因该方成分多样、作用靶点繁复，具体机制仍未明确。网络药理学可通过构建“药物-靶点-疾病”网络，系统、完整地揭示中药治疗疾病的作用机制。本研究中探讨了八珍汤治疗胃癌的网络药理学作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 活性成分筛选

在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）上，分别以“人参”“白术”“茯苓”“当归”“川芎”“白芍”“熟地黄”“甘草”为关键词进行搜索，筛选条件为药物口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18。将得到的靶点在Uniprot 网站（https：／ ／www.uniprot.org／）中转换为对应ID，同时排除部分指代不明或非“Homo sapiens”的靶点。

1.2 作用靶点预测及生物活性成分-靶点网络构建

预测筛选后的黄芪主要生物活性成分的作用靶点，根据TCMSP 提供的靶点，利用网络绘图软件Cytoscape 3.7.2 构建主要生物活性成分-靶点的作用网络。

1.3 蛋白互作（PPI）网络构建与分析

构建药物直接靶点与其他蛋白间的PPI 网络，通过String 数据库对药物靶点及疾病靶点进行PPI 分析，筛选条件为互作分数大于0.9。

1.4 目标基因富集分析

京都基因与基因组百科全书（KEGG）是系统分析基因功能、基因组信息的数据库，有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。通过KEGG富集分析得到相关的代谢通路。使用metascape 网站（https：／ ／metascape.org／），Min Overlap 选择3，P 值选择0.01，MinEnrichment 选择1.5，进行在线KEGG 通路分析。

基因本体论（GO）分析中将基因功能分成生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三部分。将上一步得到的所有靶点作为输入，使用David6.8（https：／ ／david.ncifcrf.gov ／ ）在线功能注释工具进行GO 富集分析。

2 结果

2.1 活性成分检索

得复方八珍汤组方中各中药的主要成分150 种，其中人参22 种、白术7 种、茯苓15 种、当归2 种、川芎7 种、白芍13 种、熟地黄2 种、甘草92 种。

2.2 活性成分-靶点网络构建

得到8 种中药的对应作用靶点，与2.1 项下筛选得到主要成分进行匹配，在Uniprot 网站中对对应靶点进行检索，选择物种“Homo sapiens”，排除重复的和指代不明的靶点后，得到238 个靶点，共计2 035 个对应关系（图1）。其中“共有”表示该成分在多种中药中均存在，当归和熟地无特有成分，故未单独标出。

图1 活性成分-靶点网络示意图Fig.1 Schematic diagram of active ingredient-target network

2.3 PPI 分析

筛选互作分数大于0.9 的PPI pairs，238 个药效分子靶点基因中有230 个与4 968 个疾病靶点间有相互作用，这种作用关系达22 795 个。其中，按degree 值排序排名前15的蛋白为TP53（590），MAPK1（532），CDC42（504），MAPK3（451），HSP90AA1（409），AKT1（404），JUN（387），CHRM2（380），STAT3（376），CXCL8（370），RELA（365），EGFR（361），MAPK14（336），CCNB1（327），APOB（324）。

2.4 KEGG 通路与GO 富集分析

将KEGG 分析到的通路按P 值由小到大排列，选取前20 位进行可视化，结果见图2。八珍汤对应靶点与癌症通路富集结果显著性最强，同时与MAPK 通路、cAMP 通路等细胞增殖分化和凋亡过程相关。以癌症通路为例，可观察到在PPI 网络中排名靠前的均在该通路中被富集，如TP53，MAPK1 和MAPK3（图中ERK），CDC42，HSP90AA1（图中HSP）等，详见图3。以错误发现率（FDR）＜0.05 为界筛选FDR 最小的10 条通路进行GO 富集分析，结果见图4。表明八珍汤作用靶点与癌症通路高度相关。

图2 KEGG 通路分析结果Fig.2 Results of KEGG pathway analysis

图3 癌症通路示意图Fig.3 Schematic diagram of cancer pathways

图4 GO 富集分析结果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

2.5 PPI 网络主要模块分析

利用cytoscape 软件中MCODE 插件对2.3 项下得到的PPI 网络进行模块分析，degree cutoff 选择3，其他参数默认，最终得到16 个主要模块，其中得分大于5 的有模块A（6.189 分，含75 个蛋白）和模块B（6.036 分，含221 个蛋白）。

为进一步探究模块中蛋白的功能，进行KEGG 通路分析，按显著性排序绘图，结果图6。其中与总体KEGG 分析结果相比，在肿瘤及细胞增殖周期相关的通路同样在这里得到了富集。

3 讨论

A.模块A B.模块B图5 PPI 主要模块分析A.Module A B.Module BFig.5 Analysis of PPI main modules

本研究中初步筛选出八珍汤活性成分150 个，继而挖掘出238 个靶点基因及相互作用关系2 035 个，表明中药复方作用机制具有多靶点、多途径的特点。PPI 分析所得degree 前15 名蛋白多与胃癌相关，以排名前3的蛋白为例：TP53 是由抑癌基因TP53 编码的［11］，与肿瘤形成密切相关；有研究表明，胃癌患者的MAPK1 水平显著上升，同时抑制MAPK1 的表达水平会抑制胃癌细胞的增殖［12］，CDC42 蛋白属细胞分裂周期蛋白，可激活下游MAPK／ERK 通路、PI3K／AKT 通路和PTEN 通路，在胃癌的细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭中发挥着关键作用［13］。同时，这3 种蛋白都是槲皮素的靶点，槲皮素在八珍汤中是甘草的特有成分，已有甘草提取物能抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡的报道［14］。KEGG 通路分析中也得到了类似结果，除与肿瘤形成和转录直接相关的通路外，细胞生长凋亡及信号传导的相关通路如MAPK 通路、cAMP 通路［15］、AMPK 通路［16］也得到类似显著结果。这些通路均被证实在胃癌形成或治疗过程中的作用，证明了本研究与生物医学研究可相互印证。GO 富集分析中，细胞对药物等的反应在BP 中排名靠前，说明这些蛋白主要参与细胞基础活动，同时对内源性刺激应答进行调控；MF 分析表明，这些靶点主要参与酶、蛋白、转录因子和药物结合过程；CC 分析显示，它们与细胞间质和细胞质相关的通路有关。

A.模块A B.模块B图6 PPI 主要模块蛋白KEGG 通路分析结果A.Module A B.Module BFig.6 Results of KEGG pathway analysis of PPI main module protein

综上所述，基于网络药理学和生物信息学分析能揭示八珍汤在抗胃癌过程中可能的机制，并找到关键靶蛋白，为后续研究提供重要的理论依据，也为药物作用机制的研究和药物研发提供了新思路和新方法。