冬氨酸二丁二酸醚和酒石酸配施对籽粒苋生长和镉富集特征的影响

何明倩，卢 欣，唐 妍，陈芝吟，夏涓文，徐小逊，2*，李启蓝

（1.四川农业大学环境学院，成都 611130；2.四川省土壤环境保护重点实验室，成都 611130；3.重庆市荣昌区生态环境监测站，重庆 402460）

随着工农业生产的不断发展，采矿冶炼、肥料及杀虫剂的施用、污水排放灌溉等人类活动的加剧，导致土壤重金属镉（Cd）污染日趋严重[1-2]。Cd易被植物吸收，影响植物对必需矿物质元素的吸收和运输，抑制光合作用，产生氧化应激，从而影响植物的生长发育[3]。并且，植物中积累的Cd通过食物链进入人体，直接危害人体健康[4-5]。因此，人们越来越重视Cd污染土壤的修复。

植物修复技术是指在污染土壤中种植超富集植物，利用植物对污染物进行固定、吸收，以降低污染物的有害性，或去除环境中的污染物[6]。因其具有安全、经济以及环境友好等特点，而被广泛应用于修复重金属污染土壤[7]。然而，一般情况下土壤中的重金属大多吸附在土壤颗粒上，导致重金属的生物利用度较低，难以被植物吸收[8]。添加螯合剂可以提高重金属的生物有效性，促进植物对重金属的吸收[9]。

与无机螯合剂相比，有机螯合剂更易生物降解，并且有机螯合剂能提高超富集植物的提取能力，更有利于重金属的提取[10-11]。乙二胺四乙酸（EDTA）能有效提高植物对金属的吸收，但由于EDTA的生物降解性能较差，长期吸附于土壤颗粒上，会带来二次污染等环境风险[12]。相比之下，可生物降解的多羧基氨基酸类螯合剂（APCAs）如S，S-乙二胺二琥珀酸（S，S-EDDS）和二乙基三乙酸（NTA）等，既能提高植物修复效率，又能降低螯合剂对土壤的环境风险[4，13]。螯合剂冬氨酸二丁二酸醚（AES）与 EDDS 同为天冬氨酸的衍生物，具有较高的生物降解能力和重金属亲和力，可以作为生物可降解螯合剂使用[14]。

然而高剂量的螯合剂会对植物产生毒害作用，导致植物生物量降低，从而减少植物对重金属的吸收[6]。造成这种情况的原因可能是螯合剂改变了土壤中重金属的溶解度，使土壤溶液中的重金属离子浓度增加，进而对植物造成更严重的胁迫[15]。已有研究表明外源添加酒石酸能够解除Cd对根长和根表面积的抑制，缓解Cd的毒害作用[16]。同时酒石酸能通过酸化、溶解等作用活化土壤中的矿物成分，间接促使植物营养元素含量增加，促进植物生长，提高植物对Cd胁迫的耐性。陈亚慧等[17]研究酒石酸（TA）与螯合剂EGTA单施和配施对强化蓖麻修复Cd污染土壤的效果时，发现TA可作为解毒剂减轻螯合剂活化重金属后对植物的毒害，有利于提高植物修复效率。

籽粒苋（Amaranthus hybridus L.）为苋科、苋属一年生植物，具有生物量大、易栽培和Cd耐受能力较强等特点，是一种良好的Cd污染土壤修复材料[18-20]。AES添加能否提高其对Cd的提取效率，而TA又能否缓解植物吸收大量Cd后所产生的毒性效应，目前几乎没有证据支持这一假设。因此本试验以籽粒苋为供试材料，通过研究不同用量的AES与TA单施与配施对籽粒苋生长、生理和Cd积累能力的影响，分析使用AES修复Cd污染土壤时TA作为解毒剂的可行性，以期为添加AES与TA辅助籽粒苋修复Cd污染土壤提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试植物为籽粒苋，试验用籽粒苋种子采自四川省汉源县的富泉铅锌矿区。

1.2 试验设计

1.2.1 幼苗培养

挑选成熟饱满籽粒苋种子，用0.05% NaClO浸泡消毒30 min，再用蒸馏水冲洗干净，于28℃恒温培养箱内催芽，7 d后移栽于未受重金属污染的沙土中培养，培养过程中定期浇灌1/2Hoagland营养液，经30 d培养后选择长势一致的幼苗（株高10 cm左右，5～6叶）备用。

1.2.2 盆栽试验

供试土壤为受工业污染严重的水稻土，其基本理化性质为pH值6.15，全氮和有机质的含量分别为1.13、18.75 g/kg，碱解氮、有效磷和速效钾的含量分别为78.34、14.68和122.5 mg/kg，机械组成为黏粒25.3%、砂粒35.3%以及粉粒39.4%，Cd全量为35.14 mg/kg。采集表层土（0～20 cm），将土样自然风干、压碎，过5 mm尼龙网塞。将土壤分别装进塑料花盆（直径30 cm，高度20 cm），每盆装土5.0 kg，同时每桶施4.0 g复合肥（N∶P2O∶K2O=17∶17∶17，以 NH4NO3和 K2HPO4的形式供给）。

选取长势一致的籽粒苋幼苗移栽到塑料花盆中，每盆3株。盆栽试验设计共8个处理，每个处理3次重复，具体试验设计为：①空白对照（CK）；②0.033 mmol/kg TA（T1）；③0.067 mmol/kg TA（T2）；④2.5 mmol/kg AES（A1）；⑤5 mmol/kg AES（A2）；⑥0.033 mmol/kg TA 与 2.5 mmol/kg AES（A1T1）；⑦0.067 mmol/kg TA 与 2.5 mmol/kg AES（A1T2）；⑧ 0.033 mmol/kg TA 与 5 mmol/kg AES（A2T1）；⑨0.067 mmol/kg TA 与 5 mmol/kg AES（A2T2）。盆栽第60天时，将各配比AES与TA溶于800 mL水，以溶液滴灌形式向籽粒苋根系土壤一次性加入螯合剂，处理20 d后即盆栽试验的第80天，收获植株。

1.3 测定方法

1.3.1 籽粒苋生物量的测定

籽粒苋植株分为根、茎和叶3部分样品采收，先用自来水反复将根冲洗干净，然后用去离子水冲洗3～5次，用吸水纸吸干。将植物各部分鲜样置于105°C下杀青30 min，然后在80°C烘箱内烘干至恒重，测定各器官生物量。

1.3.2 叶片抗氧化酶活性的测定

取籽粒苋新鲜叶片0.2 g，加入2 mL提前预冷的0.05 mol/L，pH 7.8的磷酸缓冲液，在冰浴条件下研磨为匀浆，于离心管中在4℃、12 000 r/min下离心20min，取上清液进行测定。

采用氮蓝四唑（NBT）法[21]测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性。SOD活性单位以抑制NBT光还原的50%所需酶量为一个酶活性单位表示。采用高锰酸钾滴定法[21]测定过氧化氢酶（CAT）活性。酶活性用每克鲜重样品1 min内分解H2O2的毫克数表示。

1.3.3 土壤中Cd形态的测定

采用改进的BCR连续提取法，测量土壤中Cd弱酸提取态、可还原态、可氧化态和残渣态的含量[22]。第一步用HAc作为提取液，测量弱酸提取态Cd含量。第二步向第一步提取后的残余物中加入提取液NH2OH·HCl，测量可还原态Cd含量。第三步向第二步提取后的残余物中加入H2O2消解，冷却后加入提取液NH4OAc，测量可氧化态Cd含量。最后将经过第三步提取后的残渣转移到聚四氟乙烯烧杯中，然后加入HNO3，HF和HClO4消解，消解液冷却后定容测量残渣态Cd含量。

1.3.4 Cd含量的测定

土壤Cd含量：分层采集土壤样品后混匀，自然风干后磨细过2 mm网筛装袋备用。称取1.000 g土壤样品置于聚四氟乙烯坩埚中，加入15 mL HF和10 mL HNO3-HClO4（1∶1，V/V）加热至近干，再加入5 mL HNO3消煮至液体呈无色、无白烟冒出，定容过滤后，采用原子火焰吸收分光光度法测定Cd含量。植物Cd含量：将根和同株茎叶样品（根为植株地下部分，同株茎叶样品为植株地上部分）分别粉碎，过1 mm尼龙网筛后混匀备用。准确称取植物样品0.300 g于三角瓶中，加入20 mL HNO3-HClO4（4∶1，V/V），消煮至液体少量无色，定容过滤后用原子火焰吸收分光光度计测定Cd含量[23]。

并计算以下参数：

各器官Cd积累量=各器官Cd含量×各器官生物量（1）

富集系数（BCF）=地上（下）部Cd含量/土壤Cd含量（2）

转移系数（TF）=地上部Cd含量/地下部Cd含量（3）

土壤净化率=（地上部Cd积累量/土壤总Cd量）×100%（4）

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2010处理数据，用SPSS 20.0对数据进行单因素方差（ANOVA）检验，采用Duncan多重比较进行处理间差异显著性检验（P<0.05），用Origin 9.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对籽粒苋生物量的影响

单施TA处理（T1和T2）显著提高了籽粒苋营养器官生物量（P<0.05），其中T2处理根、茎和叶生物量分别比CK增加了111.26%、123.12%和148.59%（图1）。单施AES对植株生物量的影响较小，仅A1处理根和叶生物量比CK有一定程度增加，而A2处理与CK相比无显著影响（P>0.05）。从图1可以看出，TA与AES配施时，随着TA浓度的增加植株地上部（茎和叶）生物量有一定程度增加，而随着AES浓度的增加，添加TA植株生物量未出现明显下降（P>0.05）。其中，A1T1和A1T2处理根、茎和叶生物量分别比CK增加77.00%～114.85%、34.27%～47.32%和35.24%～140.92%（P<0.05）。

图1 不同处理对籽粒苋生物量的影响Figure 1 Effects of different treatments on the biomass of A.Hybridus

2.2 不同处理对叶片SOD和CAT活性的影响

单施TA能显著提升籽粒苋叶片SOD活性，与CK 相比增加 111.89%～123.02%（P<0.05，图 2a），而单施AES对SOD活性无显著影响（P>0.05）。两者复配时也能显著提升叶片SOD活性，与CK相比增加99.68%～120.20%（P<0.05，图2a）。随着 TA 浓度的增加，籽粒苋叶片CAT活性显著增加，T2处理比对照提高39.79%（P<0.05，图2b）。然而，单独添加AES、TA与AES配施均未显著增加叶片CAT活性（P>0.05，图 2b）。

2.3 不同处理对土壤Cd形态的影响

未添加有机酸和螯合剂处理（CK）中弱酸提取态Cd占总Cd的比例为39.33%，TA与AES添加后各处理土壤弱酸提取态Cd所占比例有所提升，而可氧化态Cd所占比例下降（图3）。各处理弱酸提取态Cd占比为CK的1.11～1.53倍，其中A2T2的弱酸提取态Cd占比最高，为总Cd的61.72%。

图3 不同处理土壤Cd形态分布特征Figure 3 Speciation distribution characteristics of Cd in soil after different treatments

2.4 不同处理下籽粒苋对Cd的富集特征

2.4.1 Cd含量和Cd积累量

由图4所示，各处理籽粒苋的Cd含量和Cd积累量均表现为地上部>地下部。TA与AES单施对籽粒苋Cd含量影响较小。T1处理植物地上部Cd含量比CK减少了9.43%，T2处理及AES单施对籽粒苋地上部Cd含量无显著影响（P>0.05，图4 a）。TA与AES配施时，A1T2和A2T2处理可增加地上部Cd含量，其中A2T2处理比对照提高35.71%（P<0.05，图4 a），而地下部Cd含量在高浓度AES与TA配施时显著低于CK（P<0.05）。

单施TA能显著提升籽粒苋地上部和地下部Cd积累量（P<0.05，图4 b），其中T2处理地上部Cd积累量比CK增加了147.37%。单施AES对籽粒苋地上部Cd积累量无显著影响（P>0.05，图4 b）。TA与AES配施显著提升籽粒苋地上部Cd积累量，与CK相比增加24.46%～108.05%（P<0.05，图4 b）。低浓度AES与TA配施显著提高籽粒苋地下部Cd积累量，而高浓度AES与TA配施显著降低地下部Cd积累量。

图4 不同处理对籽粒苋Cd含量（a）与Cd积累量（b）的影响Figure 4 Effects of different treatments on Cd concentration（a） and Cd accumulation（b） of A.Hybridus

2.4.2 富集系数、迁移系数和净化率

各处理下的籽粒苋富集系数均表现为地上部>地下部，且地上部富集系数均大于1（表1）。单施TA和单施AES对地上部和地下部富集系数均无显著影响（P>0.05）。TA与AES配施时，随着TA浓度的增加地上部富集系数有一定程度增加，其中A1T2、A2T2处理较CK显著增加（P<0.05）。

表1 不同处理对富集系数、迁移系数和Cd净化率的影响Table 1 Effects of different treatments on bioconcentration factor （BCF），translocation factor（TF） and Cd purification rate

各处理籽粒苋的迁移系数均大于1。单施TA迁移系数较CK有一定程度减小。单施AES对迁移系数无显著影响（P>0.05）。低浓度AES与TA配施对迁移系数无显著影响（P>0.05）。高浓度AES与TA配施迁移系数显著增加（P<0.05），A2T1、A2T2 分别为CK的2.22倍、2.12倍。

单施TA显著提高了土壤Cd的净化率（P<0.05），其中T2处理土壤净化率比CK增加了147.35%。单施AES对土壤净化率无显著影响（P>0.05）。两者配施的土壤净化率显著高于对照，为CK的1.24～2.08倍，且随着TA浓度的增加土壤净化率增加。

3 讨论

3.1 强化修复条件下籽粒苋对Cd的耐受能力

在植物修复过程中添加螯合剂能活化土壤中的重金属，使土壤溶液中的重金属离子浓度增加，提高重金属的生物有效性[15]。而当重金属离子浓度过高，超过了植物激活防御系统的能力时，会导致植物生物量减少[6]。本试验中2.5 mmol/kg AES处理根和叶生物量比CK有一定程度增加，可能是因为较低浓度的AES缓和了土壤中Cd对植物的毒害作用[24]。5 mmol/kg AES处理根茎叶生物量与CK相比基本没有明显下降，这可能与AES添加浓度并不太高有关。Chen L.等[25]在含Cd土壤中添加较低浓度EDDS时向日葵根、茎和叶生物量与CK无显著差异，但随着EDDS浓度的增高，该植物营养器官生物量呈逐渐下降趋势。这些结果表明，AES添加后籽粒苋仍能维持较高的生物量，这对于提升该植物的修复效率奠定了重要基础。

植物处于逆境胁迫下，细胞内自由基产生和清除的动态平衡被打破，植物体内自由基和活性氧积累，细胞膜脂过氧化加剧，过氧化产物含量升高，植物可通过抗氧化代谢如提高抗氧化酶的活性以清除体内的活性氧[26-27]。本试验中，单施TA使SOD和CAT活性升高，且TA浓度增加，升高幅度越明显。表明添加TA后，土壤溶液中增加的Cd含量启动了籽粒苋的抗氧化酶保护系统，减轻活性氧对细胞的伤害，提高植物的Cd耐受能力，有利于植物生长[28]。这与单施TA时籽粒苋营养器官生物量显著升高的结果一致（图1）。土壤溶液中Cd含量过高时，植物体内的活性氧不断积累，超过了抗氧化能力限度，抗氧化系统的平衡遭到破坏，引起细胞代谢失调，抑制抗氧化酶的合成，酶活性降低[29]。张玉芬等[30]研究发现10 mmol/kg EDTA使蓖麻叶片SOD、POD活性被抑制。而本试验单施AES对SOD和CAT活性无显著影响，可能是因为添加的AES浓度不够高，AES活化的Cd还没有造成严重的氧化胁迫，因此对植株的生长也未产生明显抑制（图1）。AES和TA配施处理下SOD和CAT活性均大于对应浓度的AES单施处理，这与茎和叶的生物量变化一致（图1），表明添加TA缓解了土壤溶液中Cd含量过高引起细胞代谢失调而产生的影响[16]，从而使SOD和CAT活性升高，减轻活性氧对细胞的伤害，利于植物生长。同时，TA增强了籽粒苋对Cd的耐受能力，也可能是由于其添加后能通过酸化、溶解等作用活化土壤中的矿物成分，间接地促进了植物对营养元素的吸收，利于植物生长[17]。

3.2 强化修复条件下籽粒苋对Cd的积累能力

土壤中弱酸提取态重金属的生物活性和迁移性最强，更容易被植物吸收[31]。研究表明，相同浓度下，低分子量有机酸对重金属的活化能力普遍低于APCAs[11]。从本研究结果来看，AES对土壤中Cd的活化能力明显强于TA（图3），表明螯合剂对Cd的增溶效果明显，AES的络合作用使Cd从活性较低的组分中分离出来，并容易从土壤颗粒表面解吸[32]。低分子量有机酸也是重要的金属配位体，可改变土壤溶液中重金属的形态，减少土壤有机质与重金属离子的固定作用，增加重金属在土壤中的移动性[33]。然而TA对Cd的活化能力受自身矿化速度、土壤缓冲力及浓度的影响，也可能是由于TA与Cd形成的络合物不稳定[34]，因此TA活化能力低于AES。但是，本研究发现当AES与TA复配时，土壤中Cd的活化效果明显高于单施TA的处理，表明螯合剂与有机酸联合可提高Cd的生物有效性，促进籽粒苋对Cd的吸收。

植物对Cd的修复效率主要取决于植株地上部能否大量积累Cd[35]，而Cd的积累量则受植物的生物量与植物中Cd含量的共同影响。本试验中除A1T1处理，AES和TA复配下籽粒苋地上部富集系数和迁移系数分别是CK的1.04～1.30倍和1.01～2.23倍，表明两者配施对Cd从地下部向地上部迁移和Cd在植株地上部的富集有明显的促进作用。这与Wang K.等[10]的研究结果一致，该研究表明施用螯合剂后苋科植物千穗谷（Amaranthus hypochondriacus L.）对Cd的富集系数和迁移系数均能明显提升。本研究中单施AES对地上部Cd积累量无显著影响，然而TA与AES配施时，植株地上部Cd积累量和土壤净化率均大于对应浓度的AES单施处理，表明TA的添加有效缓解了AES对籽粒苋的毒害，促进了生物量的提升，进而提高了植物修复效率。由此可见，AES和TA配施既能保证籽粒苋的正常生长，又能提高植株积累Cd的能力。本研究中单施TA、AES与TA配施使土壤净化率相对于CK显著提高了24.48%～147.36%。陈亚慧等[17]发现蓖麻在EGTA与酒石酸的单施与配施处理下土壤净化率最高为0.25%，黄麻[21]、苎麻[36]在螯合剂作用下土壤净化率最高值分别为0.35%和1.22%（表2）。本研究中T2处理和A1T2处理的净化率较高，分别达1.55%和1.30%，表明T2和A1T2处理强化籽粒苋修复Cd污染土壤效果较好。

表2 不同植物在螯合剂作用下的植物修复效果Table 2 Effects of phytoremediation of different plants under chelating agents

4 结论

①高浓度的AES（5 mmol/kg）对籽粒苋生长有一定的毒害作用，而TA能缓解Cd对籽粒苋的胁迫。适当比例的AES和TA配施与AES单施相比，抗氧化酶SOD、CAT活性更高，能更有效地清除累积的活性氧。表明AES与TA配施能够提高籽粒苋对Cd的耐受能力。

②AES与TA配施时土壤弱酸提取态Cd所占比例最高，AES单施次之，TA单施时所占比例最低。

③0.067 mmol/kg TA单施时地上部Cd积累量和土壤净化率最高，分别比CK增加了147.37%和147.35%。0.067 mmol/kg TA与2.5 mmol/kg AES配施时地上部Cd积累量和土壤净化率均为CK的2.08倍。0.067 mmol/kg TA单施及0.067 mmol/kg TA与2.5 mmol/kg AES配施对加强籽粒苋对Cd的提取效率的效果较好。