驼奶中乳酸菌的分离鉴定

任冬艳，李 磊，李翠平，孙洁宇，韩毅峰，闫继彪

（内蒙古普泽生物制品有限责任公司，内蒙古呼和浩特 010080）

骆驼是我国西北和华北荒漠、半荒漠地区的重要畜种资源之一，也是这一地区草原畜牧业的重要组成部分。驼乳素有“沙漠白金”的美誉，作为一种营养价值较高的食物，驼乳虽然已经得到了世界上多数国家的认可，但是在日常生活中，人们对于驼乳依然并不熟悉，其食用并不广泛。经权威机构测定，驼乳中含有大量的维生素B、C 以及矿物元素，因此，驼乳以其丰富的营养被许多人们所青睐。由于驼乳越来越被人们所熟知，市场中驼乳的需求量增加，为游牧民族的人们带来了新的收入增长点。

采用16S rRNA 基因序列方法对乳酸菌进行分类，已经成为当今使用最多的方法[1]。研究微生物的种类有利于发掘生物多样性、微生物类群多样性、生态类型多样性、遗传多样性[2]。本研究对采自内蒙古阿拉善地区的驼奶样品中的乳酸菌进行分离鉴定，对菌种资源的挖掘和保护具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 驼奶样品来源

新鲜驼奶样品采自内蒙古阿拉善牧民家庭。将样品置于无菌容器内，低温带回实验室，4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培养基与试剂

培养基：MRS 固体培养基、MRS 液体培养基、M17 固体培养基、M17 液体培养基，由深市环凯微生物科技有限公司生产。

试剂：PBS 缓冲液、脱脂乳保护剂、细菌DNA提取试剂盒PCR 扩增和电泳所用试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品收集

收集样品采用直接取样法。采集样品并对样品进行编号标注，于4 ℃便携式冰箱内运回实验室待研究。

1.2.2 样品分离

结合乳酸菌的特性选择较为合理的分离方法，根据相关理论可知，涂布法是较为合适的方法[3]。取驼乳加生理盐水进行梯度稀释，然后吸取0.2 mL 合适的稀释液分别涂在两种固体培养基上，然后将涂有固体培养基的平板放置在培养箱内厌氧培养48 h。菌落形成后，随机挑取出形态特征不同的革兰氏染色阳性单个菌落于相应的液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h。在相应的固体培养基上划线分离，37 ℃厌氧培养48 h，如此反复纯化3～4 次，转移至相应液体培养基中增殖，进行纯化培养[4]。对纯化好的菌液进行保藏。

1.2.3 基因组DNA 提取及16S rRNA 基因的PCR扩增

用TIANampBacteria DNA Kit 提取基因组DNA，用ND-2000C 微量紫外分光光度计测其浓度和OD260/280 值。

PCR 扩增体系：5 μL Easy Taq Buffer（Mg2+）；4 μL High Pure d NTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物FA-27F（浓度为10 mmol/L）；1.5 μL 引 物RA-1495R（浓 度10 mmol/L）；0.5 μL Easy Taq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模 板（质量浓度100 ng/μL）；35.5 μL H2O。PCR 扩增采用细菌16S rRNA 基因通用引物[5]。

PCR 扩增循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃末端延伸10 min。

1.2.4 16S rRNA 序列测定和同源性分析

将PCR 产物送到派森诺生物技术有限公司进行双向测序，运用DNAStar 6.1 软件包中的SeqMan 软件将其进行拼接，最终获得1 400 bp 的有效序列。利用Blast 软件将测定的序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知分类地位的乳酸菌基因序列进行同源性比较，应用软件Mega 7.0 构建系统发育树[6]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离株的菌落形态

根据菌落的形态特征、革兰氏染色结果和过氧化氢酶试验，将从驼奶中分离到的7 株菌株初步定为乳酸菌。在固体培养基上菌落形状呈圆形，中心凸起，边缘整齐，表面光滑或者粗糙，颜色为白色或乳白色。

2.2 乳酸菌基因提取结果和16S rDNA 的扩增结果

由图1 可知，用微量紫外分光光度计测定提取得到乳酸菌菌株基因组DNA，所有分离株DNA 的纯度值（A260/A280）都 在1.8～2.0，浓度范围在100～3 000 ng/μL，分离株基因组DNA 是满足后续试验要求的。由于不存在非特异性扩增，因此可以判断菌株16S rDNA 符合条件，可以进行后续的操作，即送到指定单位进行纯化以及测序。

图1 16S rRNA 基因的PCR 扩增产物电泳结果

2.3 同源性分析

由图2 所示，菌株T2、T9 和T12 与模式株Lactococcus lactisATCC 19435 聚在一起，同源性为99%，可归为Lactococcus lactis。T4 和T10 与模式株Enterococcus gilvus ATCC BAA-350 聚类，同源性为97%，可归为Enterococcus gilvus。T5 和模式株Lactobacillus paracaseiATCC 25302（D79212）聚类，同源性为99%，可归为Lactobacillus paracasei。T8 和模式株Leuconostoc mesenteroidesNCFB529聚 类，同源性为98%，故鉴定为Leuconostoc mesenteroides。

图2 驼奶分离株的16S rRNA 基因序列的系统发育树

3 结论

本研究从驼奶中分离出的乳酸菌一共有7 株，经过一系列的分析以及测定可以判断这7 株乳酸菌为3 个 属4 个 种，包 括2 株Enterococcus gilvus，1 株Lactobacillus paracasei，1 株Leuconostoc mesenteroides，3 株Lactococcus lactis，该样品多样性较为丰富，Lactococcus lactis为优势菌种。