二氢杨梅素通过PI3K/Akt信号通路调节巨噬细胞极化抑制卵巢癌细胞的侵袭

谭武鹏， 谭 雄， 伍菊花

(衡阳市妇幼保健医院妇科，湖南省衡阳市421001)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是发病率为第三位的恶性妇科肿瘤，但其死亡率却高居妇科肿瘤的第一位[1]。卵巢癌的发病隐匿，早期的临床症状不明显，很多患者在发现并被确诊时已经处于中晚期，因而预后并不理想[2]。细胞的侵袭性生长是导致OC治疗失败的重要原因，肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAM)是肿瘤微环境的重要部分之一，与肿瘤细胞的侵袭性生长方式具有密切的关系[3]。二氢杨梅素(dihydromyrietin,DMY)是一种从植物中提取到的黄酮类化合物[4]。DMY的药理作用很广泛，如抗炎、镇痛、抗氧化和调节免疫力等[5-6]。本研究拟观察DMY处理的RAW264.7巨噬细胞对人卵巢癌细胞系SKOV3细胞增殖和侵袭能力的影响，并从PI3K/Akt/巨噬细胞极化信号途径的角度探讨其可能的机制，为卵巢癌的防治提供新的靶点和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞系SKOV3细胞由中国科学院上海库提供，RAW264.7巨噬细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。胰蛋白酶和DMEM培养基购自Gibco公司。小牛血清购自四季青生物科技公司。干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin10,IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂购自武汉博士德生物工程公司。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)细胞增殖检测试剂盒购自汉恒生物科技公司。DMY购自曼斯特生物科技公司。

1.2 细胞培养

RAW264.7细胞和SKOV3细胞均用DMEM培养液(10%含小牛血清)培养，细胞培养在37 ℃、5%CO2培养箱中。

1.3 实验分组

实验分为RAW264.7细胞组(RAW组)、SKOV3细胞组(SKOV3组)、RAW264.7细胞+DMY组(DMY+RAW组)、RAW264.7细胞+SKOV3细胞组(RAW+SKOV3组)、DMY+RAW264.7细胞+SKOV3细胞组(DMY+RAW+SKOV3组)。RAW组和SKOV3组均用DMEM培养基(含10%小牛血清)培养24 h；DMY+RAW组用DMY(60 mg/L)处理RAW264.7细胞24 h；RAW+SKOV3组用DMEM培养基(含10%胎牛血清)对两种细胞进行非接触共培养24 h；DMY+RAW+SKOV3组先用DMY(60 mg/L)处理RAW264.7细胞24 h，更换培养基，再将RAW264.7细胞和SKOV3细胞非接触共培养24 h。

1.4 CCK-8检测SKOV3细胞增殖水平

将对数生长期的SKOV3细胞制备成细胞悬液，接种于96孔培养板。在处理结束后，取CCK8试剂溶液10 μL加到培养孔，静置于室温下4 h，然后在37 ℃、5%CO2培养箱中再继续培养1 h。用只含培养基的空白对照孔进行校正，把酶标仪的波长调为450 nm，检测各培养孔的光密度值(OD值)。

1.5 Transwell检测SKOV3细胞的侵袭能力

将RAW264.7细胞制备成细胞悬液，接种于24孔培养板，密度为1×105个/孔。取半透膜(孔径为8.0 μm)放置到Transwell上室的底部。制备好基质胶，取80 μL预先制备好的基质胶，加入到Transwell的上室，置于37 ℃条件下过夜，使其固化。把SKOV3细胞制备成细胞悬液，接种于Transwell的上室中，密度为3×105个/孔。再将Transwell小室置于已经接种了RAW细胞的培养板孔中，建立非接触共培养系统。实验处理结束后取出上室，将其浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定15 min。然后在0.1%结晶紫溶液中染色30 min。取出Transwell小室，擦干水分。显微镜下观察结果，每个样本随机取视野5个，计数穿过了基质胶的细胞。

1.6 酶联免疫法检测IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平

收集细胞培养液上清，ELISA法检测IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。按照试剂盒说明书操作。采用BCA法检测细胞培养上清液中总蛋白水平，结果采用ng/g蛋白表示。

1.7 Western blot检测PI3K和Akt蛋白的表达

提取巨噬细胞的总蛋白和核蛋白，按照试剂盒说明书操作。通过BCA法检测样本的蛋白水平。取适量的总蛋白样品，加入上样缓冲液，煮沸充分变性蛋白。凝胶电泳分离蛋白后，电转的方法把蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinyl fluoride,PVDF)膜上。将PVDF膜与脱脂牛奶在室温下孵育2 h。加入兔抗人PI3K(1∶400)、p-PI3K(1∶300)、Akt(1∶500)和p-Akt(1∶500)的一抗，4 ℃过夜。Tris-Tween缓冲液洗膜3次，加入二抗，4 ℃下孵育4 h，Tris-Tween缓冲液洗膜3次。曝光、显影、定影操作，使用图像分析软件扫描胶片。核蛋白检测采用的内参是组蛋白，其他内参均是β-actin，对目的蛋白表达水平进行半定量分析。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 各组SKOV3细胞增殖和侵袭能力的比较

与SKOV3组比较，RAW+SKOV3组SKOV3细胞的增殖水平及侵袭细胞数均显著升高(P<0.05；图1)。与RAW+SKOV3组比较，DMY+RAW+SKOV3组SKOV3细胞的增殖水平及侵袭细胞数均显著降低(P<0.05；图1)。

图1 各组SKOV3细胞增殖和侵袭能力的比较a为P<0.05，与SKOV3组比较；b为P<0.05，与RAW+SKOV3组比较。

2.2 各组培养液上清中细胞因子水平的比较

与RAW组比较，DMY+RAW组培养液上清中IFN-γ和TNF-α的水平显著升高，而IL-10和TGF-β的水平显著降低(均P<0.05；图2)。

图2 各组培养液上清中细胞因子水平的比较a为P<0.05，与RAW组比较。

2.3 RAW264.7巨噬细胞中PI3K和Akt蛋白表达

与RAW组比较，DMY+RAW组RAW264.7细胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05；图3)。

图3 RAW264.7巨噬细胞中PI3K和Akt蛋白表达a为P<0.05，与RAW组比较。

3 讨 论

OC是女性生殖系统中的常见恶性肿瘤之一，具有较强的侵袭性[7]。肿瘤微环境是影响肿瘤侵袭性的重要因素，TAM是实体瘤中肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤的发展进程中发挥了关键作用[8]。DMY是一种从藤茶中分离出来的黄酮醇类化合物[9]，药理学功效广泛，如杀菌、镇痛、止咳和增强免疫力等[10]。DMY促进肺癌细胞系A549细胞凋亡，机制与上调Bax蛋白和下调Bcl-2表达有关[11]。DMY能减少小鼠乳腺癌肺转移瘤的瘤重和肺转移灶的数量[12]。本研究结果显示DMY预处理RAW巨噬细胞，显著降低RAW细胞诱导的SKOV3细胞的增殖和侵袭能力，这提示DMY可抑制TAM诱导的卵巢癌细胞的增殖和侵袭，但是其机制还不清楚。

巨噬细胞具有两种不同的功能表型，即经典活化(M1型)和替代活化(M2型)，被称为巨噬细胞极化[13]。M1型巨噬细胞有促炎反应和杀伤肿瘤细胞等作用。M2型巨噬细胞有抑制炎症和促进肿瘤侵袭等作用[14]。PI3K/Akt信号通路是调控巨噬细胞极化的重要信号途径[15-16]。本研究结果显示DMY处理显著升高共培养体系培养液中TNF-α和IFN-γ时，能降低TGF-β和IL-10水平。DMY显著上调RAW巨噬细胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表达水平。这提示DMY可诱导RAW巨噬细胞向M1型极化，这可能是DMY抑制卵巢癌细胞系SKOV3细胞的增殖和侵袭的机制之一。

总之，DMY抑制TAM诱导的SKOV3细胞增殖和侵袭，其机制与通过PI3K/Akt信号通路调节TAM的极化有关，该研究将为卵巢癌的防治提供新的靶点和策略。