不同钠盐对双孢蘑菇菌丝生长及工厂化生产产量的影响

肖婷婷,王 倩,隽加香,陈明杰,陈 辉,张津京,宋晓霞,黄建春

(上海市农业科学院食用菌研究所,农业部南方食用菌资源利用重点实验室,国家食用菌工程技术研究中心,国家食用菌加工技术研发分中心,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海 201403)

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)属草腐菌类食用菌,不仅味道鲜美,营养价值丰富,还具有很好的保健和药用效果。 我国双孢蘑菇工厂化栽培规模不断扩大,促进了产业的高速发展。 目前,江苏裕灌现代农业科技有限公司、天水众兴菌业科技股份有限公司及上海联中食用菌专业合作社等企业引进了荷兰双孢蘑菇工厂化培养料三次发酵技术,产量达到30 kg∕m2左右,一个生产周期约80 d,一年可栽培8—10 茬,实现了高度专业化、高效化、周年化生产[1]。 2020 年上海市双孢蘑菇工厂化产量达到10 158 t,相比于2019年增加了58%,仅次于金针菇和真姬菇。

双孢蘑菇三次发酵技术是将二次发酵制备的选择性培养料混合双孢蘑菇菌种后送入封闭式低压隧道中,通过自动控制空气温度、培养料温度、氧气浓度、风速等参数进行菌丝体的繁殖[2]。 在发酵过程中,培养料损失大量能量,且随着采摘潮次的增加培养料养分进一步流失,极大限制了双孢蘑菇的产量。 添加剂的使用能及时补充双孢蘑菇生长后期所需的养分,从而实现增产的目的。 欧美国家双孢蘑菇工厂化生产中,在播种或覆土阶段添加辅料已比较普遍,并且已成为提高双孢蘑菇产量的一个重要技术手段。添加的形式包括加入额外的蛋白质、碳水化合物、油或者脂质以及矿物质和微量元素[3-6],如Mami 等[7]在双孢蘑菇覆土中添加适量的圆整豆粒和玉米粒,提高了双孢蘑菇的产量、子实体数量、干物质含量、总可溶性固形物含量等。 我国双孢蘑菇工厂化生产较少专注于添加剂的使用及其营养成分的研究,双孢蘑菇发菌料中添加剂的商业化产品也非常缺乏。

双孢蘑菇的菌丝生长速度直接影响到栽培周期的长短,从而影响菇房的使用效率及工厂化生产的经济效益。 菌丝生物量的积累是双孢蘑菇子实体形成和生长的基础,探究双孢蘑菇的营养生殖特性,对提高双孢蘑菇的产量具有积极意义。 醋酸钠、柠檬酸钠水解显碱性,常用作生长调节剂类添加物。 前人研究发现,在合成麦芽提取物培养基上添加0.1 g∕L 醋酸钠可以增强双孢蘑菇子实体的分化能力[8]。 此外,醋酸钠、柠檬酸钠还可以提高草菇菌丝生长速度、生物量、产量及生物学效率[9]。 鉴于此,本研究采用一定浓度的醋酸钠、柠檬酸钠溶液处理双孢蘑菇A15 菌株,探究双孢蘑菇的菌丝生长速度、生物量积累及产量的变化,以期将研究结果应用到工厂化生产中,为双孢蘑菇添加剂商品化产品研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

双孢蘑菇A15 菌株的栽培种由美国施尔丰菌种公司提供。 双孢蘑菇三次发酵料及覆土由上海联中食用菌专业合作社提供。 醋酸钠和柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。 PDA 培养基为常规的马铃薯葡萄糖培养基。

1.2 方法

双孢蘑菇A15 菌株斜面活化后,接种于PDA 平皿上,25 ℃培养10 d,待菌丝长满平板后用于接种。将醋酸钠、柠檬酸钠作为生长调节剂,设计单因素实验,PDA 培养测定双孢蘑菇菌丝生长速度,液体培养测定菌丝生物量。 栽培试验地点为上海联中食用菌专业合作社(上海市农业科学院双孢蘑菇种植基地),分别在三次料和覆土后喷施不同浓度的醋酸钠或柠檬酸钠。

1.2.1 菌丝生长速度测定

在 1 L 培养基中分别加入 0.5 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、5.0 g 柠檬酸钠粉末(或 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸钠粉末),于121 ℃条件下灭菌20 min后倒入一次性平皿中备用。 选用同一生长状况的菌丝进行接种,在长满菌丝的PDA 固体培养基上,取直径为5 mm 的菌块接种于不同浓度的醋酸钠、柠檬酸钠培养基上,置于25 ℃条件下暗培养,用游标卡尺测定10—13 d 菌落半径,菌落半径差值(mm)与生长天数(d)比值即为菌丝生长速度(mm∕d)。 每处理4 个重复,以培养基中不添加任何试剂的处理为对照(CK)。

1.2.2 菌丝生物量测定

在 PDA 液体培养基中分别加入 0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.7 g 醋酸钠或柠檬酸钠粉末,分装于250 mL 锥形瓶内,每瓶100 mL,每处理3 个重复,以培养基中不添加任何试剂的处理为对照(CK)。 取活化后的A15 菌种菌落外围1 cm 宽的菌丝块放入均质仪中,加入100 mL 无菌水,打碎10 s,取1 mL 菌液接入250 mL 锥形瓶中,150 r∕min、25 ℃黑暗条件下培养17 d 时,菌丝处于生长旺盛阶段,第17 天时收集菌丝。 用烘干至恒重(M1)的滤纸过滤,菌丝团同滤纸共同烘干至恒重(M2),计算菌丝团干重M= M2-M1。

1.2.3 栽培试验

1.2.3.1 喷施三次料处理

试验塑料栽培筐面积为 0.1 m2。 配制质量浓度为 0.1 g∕L、0.5 g∕L、1.0 g∕L、1.5 g∕L、2.0 g∕L、2.5 g∕L的醋酸钠和柠檬酸钠溶液。 每筐称取5 kg 三次发菌料,喷施50 mL 各处理溶液,将两者充分混匀、压实,再将3.5 kg 东北泥炭土及50 g 三次发菌料搅拌均匀进行覆土,随机排列于菇房床架上,每处理4 个重复。以筐中不喷施任何溶液的处理为对照1,以喷施同样量的清水处理为对照。 若对照1 与对照无显著差异,表明双孢蘑菇的发菌料经溶液喷施对产量无显著影响。 菌丝恢复阶段通过控制菇房空气温度与回风速率使料温维持在25 ℃左右,CO2浓度在11.8 g∕m3以上,空气湿度98%—100%,对培养料连续补水4—5 d 共计用量20—22 L∕m2。 进料第7 天降温并降低 CO2浓度,催蕾,出菇期间空气温度为17—18 ℃,湿度为83%—87%,CO2浓度2.4—2.9 g∕m3,风机转速设置为 50—60 次∕s。 第 20—24 天采摘第一潮菇,采摘后将床架表面残留的菇脚清理干净,对床架表面进行补水,进入转潮期,7 d 后采摘第二潮菇,采摘后清理、补水,再次进入转潮期,7 d 后采摘第三潮菇,记录各处理每潮菇的产量。

1.2.3.2 喷施覆土处理

菇房上料的同时进行覆土。 配制质量浓度为0.1 g∕L、1.0 g∕L 的醋酸钠和柠檬酸钠溶液。 每个处理选取1 m×1.35 m 的培养料床面,等分成4 个小区,分别在打水期(3 次)、菇蕾期(1 次)、第一潮结束期(2 次)、第二潮结束期(2 次)共9 次对覆土表面喷施各处理溶液500 mL(用量需到达培养料层)。 以喷施同样量的清水为对照。 双孢蘑菇的降温、催蕾、出菇和转潮等菇房管理同1.2.3.1。 记录各处理每潮菇的产量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行Duncan 多重比较,P＜0.05 表示具有显著差异统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠对双孢蘑菇菌丝生长和生物量的影响

2.1.1 对菌丝生长速度的影响

双孢蘑菇A15 菌株在PDA 培养基上生长情况见图1,其中0.5 g∕L 柠檬酸钠处理的菌丝洁白粗壮、生长快,菌落浓密。 如图2 所示,不同质量浓度柠檬酸钠处理的双孢蘑菇菌丝生长速度依次为0.5 g∕L ＞1.0 g∕L ＞1.5 g∕L ＞ CK ＞ 2.0 g∕L。 随着柠檬酸钠浓度的升高,菌丝生长速度逐渐降低,当质量浓度为2.0 g∕L 时,双孢蘑菇菌丝生长受到了明显抑制。 可见,培养基中添加适当质量浓度(0.5 g∕L)的柠檬酸钠能够促进菌丝生长,浓度过高则会抑制其生长。

图1 不同浓度柠檬酸钠培养基上双孢蘑菇的菌落形态Fig.1 Colony morphology of A.bisporus on sodium citrate medium with different concentrations

图2 不同浓度柠檬酸钠处理对双孢蘑菇菌丝生长速度的影响Fig.2 Effects of different concentrations of sodium citrate on mycelial growth rate of A.bisporus

如图3—4 所示,0.1 g∕L 和0.2 g∕L 醋酸钠处理的双孢蘑菇菌丝生长速度快、分枝多且密,长势好。随着醋酸钠浓度继续升高,菌丝生长速度逐渐降低,当质量浓度为0.7 g∕L 时,双孢蘑菇生长速度最慢。试验表明,0.2 g∕L 醋酸钠处理能够较好地促进双孢蘑菇菌丝生长。

图3 不同浓度醋酸钠培养基上双孢蘑菇的菌落形态Fig.3 Colony morphology of A.bisporus on sodium acetate medium with different concentrations

图4 不同浓度醋酸钠处理对双孢蘑菇菌丝生长速度的影响Fig.4 Effects of different concentrations of sodium acetate on mycelial growth rate of A.bisporus

2.1.2 对菌丝生物量的影响

如图5 所示,当柠檬酸钠质量浓度为0.2 g∕L 时,双孢蘑菇菌丝生物量最高,是CK 的2.6 倍,存在显著差异。 当醋酸钠质量浓度为0.1 g∕L 与0.5 g∕L 时,双孢蘑菇菌丝生物量最高,与CK 存在显著差异,但达到 0.7 g∕L 时,菌丝生长出现了明显的抑制现象。 综上,0.2 g∕L 柠檬酸钠、0.1 g∕L 和 0.5 g∕L 醋酸钠处理可以提高双孢蘑菇菌丝生物量的积累。

图5 不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠处理对双孢蘑菇菌丝生物量的影响Fig.5 Effects of different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on mycelial biomass of A.bisporus

2.2 培养料中施用不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠对双孢蘑菇产量影响

在上述柠檬酸钠处理得到菌丝生长最快质量浓度(0.5 g∕L)、生物量最高质量浓度(0.2 g∕L)的基础上,设计柠檬酸钠浓度的栽培试验,即在双孢蘑菇三次培养料中喷施不同浓度的柠檬酸钠处理观察产量变化。喷施清水与不喷施清水处理的产量无明显差异,说明清水对双孢蘑菇产量不会造成影响(图6—8)。 双孢蘑菇三潮总产量统计表明:0.5 g∕L、1.0 g∕L 柠檬酸钠处理的双孢蘑菇产量高于CK,分别提高了12.7%、6.4%;其中0.5 g∕L 柠檬酸钠处理蘑菇产量最高,主要表现在第一潮及第三潮产量高于CK(图8)。 醋酸钠不同浓度栽培试验结果显示,在双孢蘑菇三次培养料中喷施不同浓度的醋酸钠对双孢蘑菇产量无明显影响(图8),可能是双孢蘑菇菌丝恢复阶段补水过多,导致培养料积水腐烂,使D 处理产量降低。

图6 不同浓度柠檬酸钠喷施三次料的双孢蘑菇出菇情况Fig.6 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate

图8 不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠喷施三次料对双孢蘑菇产量的影响Fig.8 Effects of spraying three-time cultivation material with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate on the yield of A.bisporus

图7 不同浓度醋酸钠喷施三次料的双孢蘑菇出菇情况Fig.7 Fruiting situation of A.bisporus sprayed three-time cultivation material with different concentrations of sodium acetate

2.3 覆土上喷施高、低浓度柠檬酸钠和醋酸钠对双孢蘑菇产量影响

将钠盐进行生产应用,培养料栽培面积从0.1 m2扩大到1.35 m2,借鉴上述得到的钠盐促进菌丝生长、提高产量的最适浓度开展试验。 在双孢蘑菇覆土后的表面喷施不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠溶液处理,观察出菇情况(图9)。 40 d 后统计双孢蘑菇产量,结果表明:不同浓度的柠檬酸钠处理均可提高双孢蘑菇产量,且在第一潮较明显;喷施0.1 g∕L、1.0 g∕L 柠檬酸钠使双孢蘑菇产量分别提高了19.8%、21.6%(图10)。 醋酸钠处理结果显示,0.1 g∕L 醋酸钠处理使双孢蘑菇产量提高了17.4%,主要提高了第一潮菇产量,而1.0 g∕L 醋酸钠处理对产量无明显影响。

图9 不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠喷施覆土的双孢蘑菇出菇情况Fig.9 Fruiting situation of A.bisporus sprayed covering soil with different concentrations of sodium citrate and sodium acetate

图10 覆土后喷施不同浓度柠檬酸钠和醋酸钠处理对双孢蘑菇产量的影响Fig.10 Effects of spraying different concentrations of sodium citrate and sodium acetate after covering soil on the yield of A.bisporus

3 结论与讨论

本研究表明,在培养条件和接种条件一致的情况下,一定浓度的醋酸钠或柠檬酸钠处理对双孢蘑菇菌丝生长及产量有较明显的影响。 其中,0.1 g∕L 醋酸钠处理对双孢蘑菇菌丝生长及生物量有促进作用,覆土上喷施相同浓度溶液使双孢蘑菇产量提高了17.4%,而培养料中喷施效果不明显。 0.5 g∕L 柠檬酸钠处理可提高双孢蘑菇菌丝生长速度及生物量积累,喷施培养料使产量提高了12.7%;覆土后喷施0.1 g∕L、1.0 g∕L 柠檬酸钠使产量分别提高了 19.8% 、21.6% 。

侯立娟等[10]研究表明,0.7 g∕L 醋酸钠或柠檬酸钠处理可显著增加草菇液体培养菌丝生物量,从而有助于提高草菇产量,原因可能是添加醋酸钠后使培养基质的pH 更有利于草菇菌丝的生长。 本研究表明,随着醋酸钠或柠檬酸钠处理浓度的升高,pH 会稳定在一定范围内,可能是醋酸钠、柠檬酸钠水解释放碱性离子,起到了很好的缓冲作用,栽培生产中可避免因培养料pH 下降不利于蘑菇生长的情况。

本研究中,0.5 g∕L 柠檬酸钠处理可以加快双孢蘑菇菌丝生长速率、提高菌丝生物量,与林金盛等[9]研究结果相似。 吴风雅等[11]研究表明,使用10 g∕L 醋酸溶液在双孢蘑菇第三潮后每潮间期喷洒一次,有利于增补营养或促进覆土中微生物系适度发展,进而促进双孢蘑菇发育,可普遍增产10%左右。 本研究采用0.1 g∕L 醋酸钠溶液在双孢蘑菇覆土后每潮间期喷施,可增产17.4%,最适浓度产生差异的原因可能是醋酸钠喷施的阶段不同。 此外,Hou 等[12]在“喷重水期”(播种后5 d)用0.2 g∕L 醋酸钠处理草菇栽培基质,有一定的增产效果,可能是草菇产生多种胞外酶,将大分子营养物质逐步降解为可溶并易于吸收利用的小分子糖类物质,为草菇营养生长、菌丝分化、原基形成提供养分。 本研究结果与之相似,同属草腐菌的双孢蘑菇覆土后喷施0.1 g∕L 醋酸钠,产量提高了17.4%。

利用本研究得到的醋酸钠、柠檬酸钠溶液可以提高双孢蘑菇产量的结果结合蘑菇生长所需的碳源、氮源及微量元素等配制成添加剂产品,有助于解决工厂化生产中因培养料养分消耗限制蘑菇产量的问题。 醋酸钠、柠檬酸钠使草腐菌增产的原因可能是补充了微量元素,或提供了菌丝生长利用的能量物质,亦或是增加了代谢通路中重要基因的表达,如改变相关酶的调控活力等。 对于醋酸钠、柠檬酸钠提高双孢蘑菇产量作用的分子机理及相关添加剂产品有待进一步探究。