海岛棉抗枯萎病性状与 SSR标记的关联分析

陆小双，张梦洁，韩万里，龙遗磊，刘鹏飞，陈全家，曲延英，邓晓娟

(新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】棉花枯萎病病原菌为尖镰孢萎蔫专化型(Fusariumoxysporum.f.sp.Vasinfectum(Atk.) Snyder and Hansen)，属于土传维管束病害，该病菌在土壤中存活年限长，一般在苗期或现蕾期出现发病高峰，该病的发生受多种因素的影响，防治起来困难[1-2]。【前人研究进展】2014～2018年5年间我国棉花枯萎病的平均发病面积为36.42×104hm2·次，造成19.70%的产量损失[3]。施用生物有机肥能够降低棉花枯萎病的发病率，增产约3.1%～10.8%，但增加栽培成本[4]。【本研究切入点】轮作倒茬的方式虽然可以有效抑制棉花枯萎病的发生，但也受耕地资源限制[5]。棉花抗病新品种的选择和培育是最为有效的解决途径之一[6]。传统大田育种方法不仅周期较长，传统的病圃鉴定耗时耗力且准确性较差[7]，分子标记技术的成熟与发展为棉花抗病品种选育提供了新的技术支持[8]。【拟解决的关键问题】鉴定204份海岛棉种质资源，分析获得的海岛棉抗病基因SSR分子标记，筛选获得关联的海岛棉抗枯萎病分子标记，为棉花分子标记辅助育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为以 204 份海岛棉材料构成的自然群体，由新疆农业大学农学院作物遗传育种实验室提供。

菌种为尖孢镰刀菌七号生理小种，由新疆农业大学农学院提供。表1

表1 204份海岛棉材料来源Table 1 The origin regions of 204 sea island cotton accessions

在新疆农业大学农学院棉花培养室室内鉴定棉花枯萎病抗性。将棉花材料种在直径约为10 cm的营养钵里，每钵种1个材料，每钵播种5粒种子，3次重复，挂牌标记。采用一般肥水管理。

在新疆农业大学农学院植物病理系棉花病害研究室制备马铃薯液体培养基。将挑取枯萎病菌单菌落接种于马铃薯液体培养基中，25℃、200 r/min震荡培养1周以上，用细胞计数器计数菌液浓度达到1×107个/cm2时备用。

1.2 方 法

1.2.1 海岛棉资源群体枯萎病抗性的室内鉴定

待棉花幼苗2片子叶展平时，用灭过菌的剪刀将营养钵底部剪掉1 cm左右，然后放在含有枯萎病菌的培养皿中沾取菌液后，放回原处。在接种3周后开始调查和统计室内病情，待病情稳定后调查发病率。

棉花枯萎病株分级标准采用国家统一标准[9]。表2

表2 棉花枯萎病级划分标准Table 2 The classification standard of cotton Fusarium wilt

采用病情指数来鉴定棉花株系的枯萎病抗性，参考有关资料，将鉴定材料分为免疫(I)、高抗(HR)、抗病(R)、耐病(T)和感病(S)5个等级[10]。表3

表3 棉花材料抗病性划分标准Table 3 Criteria for disease resistance of cotton materials

1.2.2 SSR分子标记开发、鉴定和评价

利用黄启秀等[11]报道的5个海岛棉抗枯萎病基因，通过primer5.0设计SSR分子标记40对。以4个抗病材料和3个感病材料(抗病材料为06-146、埃棉2号、DJ-07-136和Pimas-7，感病材料为新海14号、海92-3和埃及棉424)对SSR引物进行初步筛选。获得的特异条带在海岛棉资源群体中分析，验证分子标记的适用性。

以棉花幼苗真叶期叶片为材料，用改进的 CTAB 法提取DNA[12]。所用 SSR引物由新疆昆泰锐生物技术有限公司合成。PCR 反应程序：95℃ 预变性 5 min； 30 个循环( 94℃ 变性 30 s，58℃ 退火温度 45 s，延伸30 s)； 72℃ 延伸 10 min；4℃ 保存。使用浓度为 8% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳对 PCR 扩增产物进行分离，待跑完电泳以后，银染依据郭大龙等[13]方法照相保存。表4

表4 SSR引物及基因来源Table 4 SSR primers and gene sources

2 结果与分析

2.1 群体室内抗病性鉴定结果

研究表明，204份海岛棉资源材料中，高抗材料(HR)2份(中国新疆和内地各1份)，占所测定棉花材料的0.98%；抗病材料(R)34份(中国内地11份，苏联10份，中国新疆7份，美国2份，未知4份)，占所测定棉花材料的16.67%；耐病材料(T)107份(中国新疆29份，前苏联26份，中国内地22份，埃及10份，美国8份，未知12份)，占所测定棉花材料的52.45%；感病材料(S) 61份(中国内地18份，中国新疆10份，前苏联9份，美国5份，埃及5份，阿尔巴尼亚2份，未知12份)，占所测定棉花材料的29.90%；无免疫材料。表5

表5 海岛棉材料的室内鉴定结果Table 5 Indoor identification results of island cotton materials

2.2 分子标记筛选

研究表明，共有6对引物与抗病性具有多态性。CHS-04和CHS-05重复性较强。引物CHS-04扩增下抗病品种06-146、DJ-07-136、埃棉2号和Pimas-7扩增出一条特意差异带，条带大约为1 350 bp，而感病品种新海14号和埃及棉424未能扩增出这条带，而是400 bp的带。引物CHS-05扩增下感病品种新海14号、海92-3和埃及棉424扩增出两条差异带，大小约为400 bp 和 630 bp，而抗病材料DJ-07-136扩增出一条带，约为630 bp，06-146、Pimas-7和埃棉2号均未能扩增出这两条带。图1，表6

注：A：CHS-04 PCR 扩增产物M：D2000 Maker；1：新海14号；2：06-146；3：埃棉2号；4：DJ-07-136；5：Pimas-7；6：海92-3；7：埃及棉424 B：CHS-05 PCR 扩增产物M：D2000 Maker；a：新海14号；b：06-146；c：埃棉2号；d：DJ-07-136；e：Pimas-7；f：海92-3；g：埃及棉424

表6 引物筛选PCR扩增电泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

续表6 引物筛选PCR扩增电泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

2.3 抗病性分子标记与枯萎病抗性关联鉴定

研究表明，引物CHS-04扩增抗病条带与抗病材料一致率为1；与感病材料一致率较低，为0.67。引物CHS-05扩增感病条带与感病材料一致率达到1；与抗病材料一致率较低，为0.875。表7

表7 抗病材料普遍条带与材料抗性的一致率Table 7 Consistent rate of common strips and resistance of resistant materials

2.4 抗病关联分子标记的评价

研究表明，引物CHS-04扩增条带与群体材料一致率介于41.67%～52.94%，平均值为46.67%。引物CHS-05扩增条带与群体材料一致率介于30.39%～54.68%，平均值为35.78%。图2，图3，表8

注：M：D2000Maker；1：苏K202；2：新海35号；3：吐77-104；4：跃61；5：孔雀200；6：吉1；7：NMGB-16；8：司-6002；9：巴1248；10：鸡爪海岛棉长；11：跃51；12：90199；13：云南4号；14：海92-2；15：巴3119；16：9078依；17：军海1号；18：墨-1413；19：阿101；20：吉2；21：新海34号；22：新海27号；23：910u；24：7059；25：长绒；26：5917；27：吐82-6-17；28：吉扎31；29：NMGB-2；30：新海36号；31：海岛棉3；32：K366；33：NMGB-10；34：C-6019；35：7051；36：H3549，下同

图3 引物CHS-05扩增部分群体材料PCR产物电泳Fig.3 PCR product electrophoresis of primers CHS-05 amplified parts of the population material

表8 引物CHS-04、CHS-05扩增部分群体材料PCR条带一致率Table 8 PCR band consistency rate of primers CHS-04 and CHS-05 amplified parts of the population materials

3 讨 论

3.1 类黄酮代谢途径与棉花枯萎病抗病基因的关联

目前已知的类黄酮化合物结构有6 000多种，当存在微生物侵染时，类黄酮作为植保素在植物体内积累以保护植物，可以阻止植株真菌孢子发芽[14]。查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是类黄酮合成途径中的第1个关键结构酶，催化生成的查尔酮是多种类黄酮代谢途径的前体，CHS超基因家族起源古老，而查尔酮合成酶是CHS基因家族的核心酶[15]。CHS基因涉及植物的花色、育性和逆境反应等多种功能[16]。赵学荣等[17]从苦荞中克隆获得FtCHS1基因侧翼序列PFtCHS1，4℃处理后苦荞叶子中FtCHS1基因的表达量在24 h内呈现“缓慢下降-急剧上升-骤然下降”的变化，PFtCHS1可响应低温胁迫。马立功等[18]从向日葵耐病品种龙食葵2号中克隆出HaCHS，研究发现在低温、创伤和JA诱导后HaCHS基因表达量显著提高，推测HaCHS可能在植物逆境胁迫应答中起作用。王爽[19]以抗病品种灰皮支黑豆和感病品种williams82为材料，用大豆胞囊线虫3号生理小种进行侵染胁迫，试验显示抗病品种灰皮支黑豆中CHS5、CHS7、CHS8、CHS9基因5dpi时均明显上调表达，初步说明CHS基因在抗病品种抗性机制中的重要作用。黄启秀[11]研究显示，接种病菌后的CHS基因在海岛棉枯萎病抗病材料中表达活跃，CHS基因在海岛棉抗枯萎病中起着作用。

3.2 SSR分子标记技术在棉花抗病基因开发中的应用

SSR( Simple sequence repeat) 即简单序列重复，又称微卫星DNA，指的是一般1～6个核苷酸为重复单位串联组成的简短序列[20]。SSR分子标记技术因其对模板DNA要求低，过程简单，基因组覆盖范围广，再现性好等诸多特点而应用广泛[21]。甄瑞等[22]以高抗黄萎病海岛棉与高感黄萎病陆地棉品系的F2群体为材料，采用SSR分子标记筛选得到海岛棉黄萎病抗性基因连锁分子标记BNL3255208，位于第5号染色体的短臂上。杜威世等[23]以高抗黄萎病海岛棉与高感黄萎病陆地棉品系的F2单株群体作为材料，利用SSR分子标记检测到1个黄萎病抗性的QTL位点,位于SSR标记位点BNL1414和BNL3556之间。陈勋基等[24]以高抗枯萎病陆地棉与海岛棉感病品系的F2∶3群体为材料，利用SSR标记构建连锁图谱，共检测到4个与棉花枯萎病相关QTL效应，分别位于3、15、23和26连锁群上。朱永军等[25]以高感枯萎病海岛棉品种新海21号与高抗枯萎病海岛棉品系HK237构建的P1、P2、F1、F2、F2:3、BC1为材料，利用BSA法对2000对SSR引物进行筛选并进行遗传连锁分析，筛选得到分子标价NAU3240与抗枯萎病基因位点之间紧密连锁，两者之间的遗传距离为19 cm，该标记位于棉花D11(Chr.21)染色体区域。试验采用传统方法设计SSR标记引物，所获得的与海岛棉枯萎病抗病基因相关联SSR分子标记是否与前人研究相同，还需对其所处基因连锁群进行进一步定位比较后才能确定。

4 结 论

使用由海岛棉枯萎病抗病相关基因设计出的40对SSR引物，对204份海岛棉种质资源进行PCR扩增，有2对引物扩增出特异条带，均来源于类黄酮代谢途径CHS基因。引物CHS-04和CHS-05扩增条带与群体抗病性的高一致率，2对引物可以作为海岛棉枯萎病抗性的分子标记鉴定指标。