坏死性凋亡与脑卒中的研究进展*

钟伟杰 刘文武 李 轶△

（1 上海交通大学医学院附属第九人民医院神经外科，上海 200011；2 海军特色医学中心潜水与高气压医学研究室，上海 200433）

卒中是由大脑血供不足而导致脑组织缺血从而引发的一系列危及生命的症状[1]，主要分为缺血性卒中和出血性卒中。尽管近年来卒中的发病率仍在增加，但是由于卒中预防教育的加强、卒中中心的建立、早诊断早治疗以及护理质量的改善等，卒中的死亡率趋于下降[2]。但是，卒中仍然是全球第二大最常见的疾病，全世界9%的死亡与卒中相关[3]。当前，卒中的治疗主要包括溶栓治疗、抗凝、抗血小板以及活性氧清除、内皮一氧化氮合酶激活剂等[4]。其中仅溶栓治疗的疗效最为确切，但因受到溶栓时间窗的限制，导致溶栓治疗的广泛应用受限。因此亟需进一步开发用于治疗卒中的新疗法。

脑卒中可能通过谷氨酸的过度激活、离子失衡和过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生导致神经功能障碍，其损伤机制有坏死或程序性细胞死亡的参与[5]。细胞凋亡、自噬和坏死性凋亡是研究较多的3种程序性细胞死亡方式。脑缺血研究表明，梗死区的神经元主要表现为坏死，而在卒中后的最初几个小时内，细胞凋亡是缺血半暗带或坏死周围组织神经元的主要死亡形式[6]。细胞凋亡是一种受调节的细胞死亡，在形态学上与坏死存在明显不同[7]。长期以来，细胞坏死被认为是病理情况下（物理性或化学性刺激、缺氧、营养不良等）出现的一种被动死亡。随着研究的进展，有证据显示，某些坏死细胞的死亡类似于细胞凋亡，也受到一定的调控。Chan等[8]于2003年首先提出“坏死性凋亡”这一概念。2005年，Degterev等[9]在缺血性脑损伤模型中抑制caspase-8后发现，necrostatin-1（Nec-1）可抑制由Fas /肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）下游的受体相互作用蛋白1（receptor-interacting protein kinase 1，RIP1）介导的细胞坏死，而非细胞凋亡。种种研究表明，这种类型的细胞死亡受到调控，并且发生于凋亡之后，被称为“坏死性凋亡”（necroptosis）[10]。近年研究表明，坏死性凋亡与多种疾病（包括卒中）的致病有关[11]。本文主要介绍坏死性凋亡抑制剂的研究进展，基于动物实验研究总结坏死性凋亡在卒中致病中的作用，并提出靶向坏死性凋亡在脑卒中治疗时存在的一些问题。

1 坏死性凋亡的概述

坏死性凋亡与凋亡、自噬是研究较多的细胞死亡模式，主要基于形态学特征、死亡途径与方式以及是否可控等特征进行区分。形态学上，坏死性凋亡的细胞膜、细胞质以及线粒体等细胞器会发生肿胀，细胞质呈现空泡化，但坏死性凋亡无核碎裂[12]。而细胞发生凋亡时，细胞质和细胞器出现碎裂，细胞核出现凝聚和分裂，同时有凋亡小体的形成。对于细胞自噬，透射电镜可观察到其特有的3种形态学结构，吞噬泡、自噬小体和自噬溶酶体[13]。调节这3种程序性死亡的途径也存在差异，各自也有特殊的分子标志物。坏死性凋亡通过RIP1、RIP3和MLKL来调节，并受半胱氨酸天冬氨酸酶的抑制作用。而凋亡主要通过Bcl-2家族蛋白信号途径调节，与半胱氨酸天冬氨酸酶的活化密切相关[5]。细胞自噬相关蛋白（autophagy-related gene product，ATG）被认为是参与自噬体形成过程中的关键蛋白，微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）则常被应用于细胞自噬体数量的检测[13]。

研究表明，诸多因素都会触发坏死性凋亡，包括：肿瘤坏死因子（TNF）家族成员、Toll样受体激活（TLRs）及其他病原微生物等[14]。当半胱氨酸蛋白酶8（caspase 8）受到抑制时，细胞凋亡被抑制，坏死性凋亡被活化[15]。RIP1和RIP3结合形成被称为“坏死小体”的复合物，而后诱导RIP3自磷酸化。RIP3使混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）磷酸化，诱导MLKL寡聚物形成，移位至细胞膜，导致其破裂，最终破坏细胞[16]。并且，细胞坏死性凋亡会进一步放大炎症反应以及线粒体氧化应激形成恶性循环[5]。

RIP家族包括RIP1～7，其中与坏死性凋亡关系最密切的是RIP1和RIP3[17]。两者均含有1个丝氨酸-苏氨酸结构域，并且具有激酶和非激酶的作用。RIP1的中间结构为RIP同型结构域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），后者发挥启动多个下游信号转导通路的作用。RIP3具有和RIP1相似的RHIM[18]。RIP1与RIP3之间便是通过其RHIM结构域之间的结合而形成“坏死小体”。而且RIP3可以通过其RHIM序列与其他信号分子相互作用从而对坏死性凋亡的信号进行整合[19]。RIP1与RIP3的结合则会招募MLKL，并触发其构象改变，最终导致细胞破裂[20]。因此，坏死性凋亡研究中常通过检测RIP1、RIP3及其两者的结合来评价。

2 坏死性凋亡的抑制

对于坏死性凋亡的认识，主要来源于坏死性凋亡抑制剂以及基因修饰技术。迄今为止，人们已经开发了一些坏死性凋亡的抑制剂。

2.1 RIP1抑制剂

2005年，在筛选小分子表型时发现了第1个坏死性凋亡抑制剂Nec-1，它可抑制RIP1激酶和吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）的活性。目前，已经开发出几种结构不同的Nec（Nec-1、Nec-3、Nec-4、Nec-5、Nec-7），其中Nec-7不具备抑制RIP1激酶的作用[21]。Nec-1 stable（Nec-1s；7-Cl-O-Nec-1）是Nec-1的类似物，它不会抑制IDO活性，而且血浆稳定性和RIP1的特异性增加，也无类似Nec-1的毒性[22]。

2.2 RIP3抑制剂

目前有3种RIP3激酶抑制剂：GSK'840、GSK'843和GSK'872。与RIP1激酶抑制剂相比，GSK'840、GSK'843和GSK'872能高特异性地结合激酶结构域，并抑制激酶活性，靶向坏死性凋亡的作用更广泛[23]。但是，GSK'840在人体细胞能发挥作用，而对小鼠细胞无影响，这妨碍了它在鼠模型中的评估。

2.3 MLKL抑制剂

Necrosulfonamide（NSA）是一种抑制MLKL的复合物，用于确认MLKL为RIP3的下游靶标。由于NSA能烷基化人MLKL的Cys86，而鼠MLKL中不存在Cys86，因此NSA无法抑制鼠细胞的坏死性凋亡，不适合用于鼠临床前研究。

3 坏死性凋亡与脑卒中

3.1 脑卒中体外研究

一些研究表明，坏死性凋亡与卒中的致病密切相关，因为使用Nec-1等抑制剂或对坏死性凋亡相关蛋白进行基因调节，可改善卒中后的脑损伤和神经功能。Liu等[24]报道TNF-α诱导的HT-22海马神经元毒性与坏死性凋亡有关，且这些细胞仅在半胱天冬酶阻断后才对TNF-α敏感，随后发生坏死，并且敲低去泛素化酶（cylindromatosis，CYLD）、RIP1、RIP3或MLKL可以抑制细胞坏死性凋亡。在对谷氨酸诱导的小鼠海马神经元（HT-22）细胞中显示，坏死性凋亡与多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（ADP ribose）-polymerase， PARP）活化有关[25]。研究采用血红蛋白或血红素处理神经元，模拟颅内出血，结果观察到铁死亡和坏死性凋亡，但未观察到caspase依赖的凋亡或自噬，而抑制坏死性凋亡，对血红蛋白或者血红素诱导的毒性具有保护作用[26]。Qu等[27]研究了MLKL介导的缺血缺氧后神经元损伤机制。氧-糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）环境下，神经元给予caspase抑制剂ZVAD处理后，RIP1和RIP3表达上调，RIP1和RIP3与MLKL相互作用增加，而MLKL表达沉默后能改善OGD诱导的神经元坏死性凋亡。脑缺血体外模型中，RIP1和RIP3表达增加和形成坏死小体，并且OGD后caspase 8 mRNA的表达瞬时降低；RIP3敲除能改善OGD诱导的神经元坏死性凋亡，而RIP3过表达则导致OGD诱导的神经元坏死性凋亡恶化[28]。有研究显示，坏死性凋亡是缺血性损伤后24 h内细胞死亡的早期机制[29]，这一点与细胞凋亡不同[30]。

OGD处理的少突胶质细胞，RIP3表达上调，RIP3与RIP1、MLKL和CaMKⅡδ的相互作用增加，而抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ相互作用则可抑制OGD诱导的少突胶质细胞死亡，而抑制RIP3-RIP1相互作用后未观察到该现象[31]。Dai等[32]报道，铁超载也可导致原代皮质神经元坏死性凋亡，而姜黄素能抑制氯化亚铁诱导的坏死性凋亡。兴奋毒性也是缺血性卒中时组织损伤的关键机制。研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸诱导的大鼠皮层神经元兴奋性毒性也与坏死性凋亡有关[33]。

3.2 缺血性脑卒中动物研究

Degterev等[9]首次发现，坏死性凋亡与大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）导致的脑损伤有关，且其致病机制与凋亡不同，Nec-1可抑制坏死性凋亡的关键步骤（而非凋亡），对MCAO动物发挥神经保护作用。动物研究显示，中度缺血性脑卒中，坏死性凋亡主要见于病变中心，重度缺血性脑卒中周围的坏死性凋亡比中度损伤脑组织明显更多，并且坏死性凋亡细胞在周围梗塞区域和病变核心一样活跃[34]。脑缺血再灌注损伤可通过诱导坏死性凋亡，促进脑出血和神经炎症反应；RIP1活化先诱导坏死性凋亡，随后出现凋亡[35]。有研究者也评估了脑卒中时坏死性凋亡的细胞特异性：caspase 8主要见于神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的星形胶质细胞和Iba-1阳性的小胶质细胞，而NeuN阳性神经元中不表达。因此，caspase 3和caspase 8可能不参与海马CA1神经元坏死性凋亡的调节[36]。全脑缺血模型中，再灌注之前皮层就出现坏死性凋亡，再灌注后72 h仍可检测到，而且海马的坏死性凋亡不如大脑皮质明显；并且坏死性凋亡与TNFR1无关[37]。

研究主要通过基因调节或抑制剂对坏死性凋亡进行干预，探讨坏死性凋亡与脑卒中的关系。Degterev等是最早研究Nec-1神经保护作用的团队。随后，不同的研究团队在不同的脑卒中模型中证实了坏死性凋亡抑制的神经保护作用。研究显示，Nec-1对由缺血再灌注损伤引起的海马神经元坏死性凋亡的保护作用与抑制RIP3上调和核转运有关[36]。RIP1激酶突变、RIP3敲除和MLKL敲除通过阻断坏死性凋亡对大鼠MCAO诱导的急性脑缺血发挥保护作用。急性缺血性卒中疾病中，RIP1和RIP3活化导致炎症相关信号途径激活[37-38]。敲除RIP1对神经元损伤发挥神经保护作用，可能与抑制RIP1-RIP3结合诱导的氧化损伤和炎症有关[39]。在新生鼠缺血缺氧性脑病模型中，抑制RIP3-MLKL或RIP3-CaMKⅡδ的相互作用，能缓解髓鞘损伤[31]。Xu等[40]报道，Nec-1对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用，同时给予凋亡抑制剂Gly（14）-humanin具有协同神经保护作用。全脑缺血再灌注损伤模型中，Nec-1和3MA（自噬抑制剂）预处理能显著抑制神经元坏死性凋亡和大鼠死亡率，并且损伤后伴有RIP3和AIF的核易位、共定位以及两者之间的相互作用[41]。在高糖血症小鼠脑缺血再灌注损伤模型中，也证实了Nec-1s的神经保护作用[42]。此外，即使在损伤发生后6 h使用Nec-1s，也可观察到神经保护作用。他们推测，Nec-1s可延长神经保护的时间窗，另一方面反映了卒中时坏死性凋亡的延迟诱导[40]。

肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）也与小鼠MCAO诱导的细胞坏死性凋亡有关，而Nec-1预处理能抑制TRAF2敲除导致的细胞坏死性凋亡[43]。近期研究显示，RIP3敲除能抑制血脑屏障损伤和炎症诱导的神经元损伤，MCAO能诱导转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor-activated kinase 1，TAK1）（RIP1的一个抑制剂）的降解，并诱导坏死性凋亡向凋亡过渡；而敲除小胶质细胞/浸润巨噬细胞和神经元的TAK1，可加重脑缺血[35]。在缺血再灌注损伤模型中显示，M1型巨噬细胞可通过分泌TNF-α，诱导内皮细胞坏死性凋亡，导致血脑屏障通透性增加，而给予英夫利昔单抗（TNF-α单抗）可明显改善内皮细胞坏死性凋亡，抑制血脑屏障通透性增加，从而改善卒中预后[44]。此外，缺血后1 h和24 h给予salubrinal（选择性eIF2α抑制剂），能抑制坏死性凋亡和神经元丢失，说明内质网应激也参与了坏死性凋亡[37]。以上证据表明，坏死性凋亡与缺血性卒中密切相关，并且对其进行调控可以改善缺血性卒中后脑损伤和神经功能。

3.3 出血性脑卒中动物研究

在胶原酶诱导的脑出血模型中，脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）后24 h电镜下观察到坏死性凋亡的超微结构，而RIP3缺陷小鼠ICH后坏死性凋亡细胞较少[45]。在自体血注射的蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）模型中，Shuai等[46]报道，SAH后RIP3在大鼠脑表达增加，损伤后24 h达到峰值。此外，使用RIP3抑制剂（GSK872）或者敲除RIP3可降低SAH诱导的脑损伤，而过表达RIP3则加重脑损伤和神经损伤。通过药物抑制RIP1或基因敲除RIP1，能改善ICH动物的脑水肿和神经系统功能，含氧血红蛋白诱导的离体细胞模型中也证实该结果[47]。Nec-1可显著减少胶原酶诱导的ICH动物脑血肿体积，抑制细胞坏死性凋亡，减少血脑屏障开放，缓解水肿，改善神经行为学[48]。在血管内穿刺诱导的SAH大鼠模型中显示，脑内RIP1、RIP3、磷酸化DRP1和NLRP3炎症小体含量增加，而给与Nec-1能抑制RIP1、RIP3、磷酸化DRP1表达和NLRP3炎症小体，减轻脑损伤[49]。SAH后脑室内给予Nec-1，可抑制cAMP反应元件结合蛋白和脑源性神经营养因子的下降，从而抑制坏死性凋亡，发挥神经保护作用[50]。此外，Nec-1预处理能抑制SAH大鼠脑内基质金属蛋白酶9活化，从而减少紧密连接蛋白的降解，抑制血脑屏障通透性增加和神经炎症，发挥神经保护作用[51]。Nec-1在抑制坏死性凋亡的同时，也能通过抑制凋亡和自噬，对ICH发挥神经保护作用。

4 展望

在过去对卒中的研究中，大量的药物在临床前研究被证明有效，但并未在后续的临床试验中获得证实。因此，对于坏死性凋亡在临床卒中的治疗作用，还需要大量的研究进行探索。除此之外，卒中时其他细胞是否也会出现坏死性凋亡及其在卒中中的致病作用，也需要进一步的探究。总的来说，尽管抑制坏死性凋亡很有可能作为临床上治疗卒中的靶标，但仍需更多的临床前和临床研究以证实这些治疗的疗效及其安全性，为临床使用奠定基础。