叶酸基因多态性与胎儿神经管缺陷的研究进展

裴娇娇， 黄超林， 谢江燕

(成都医学院第一附属医院妇产科， 四川 成都 610500)

1 概 述

胎儿神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是仅次于先天性心脏病的第二种最常见的严重出生缺陷，在全世界，每1000例中就有1例NTDs，给家庭和社会带来了巨大的负担和压力。神经管发育开始于妊娠的第3～4周，由中胚层中背侧部分神经板的底层脊和前脊索折叠形成，并通过神经元的形成封闭前后神经孔。如果在整个神经发育过程中受到某些致病因素的影响，则会导致NTDs。NTDs可存在于从大脑到脊髓的任何部位，分为开发性神经管畸形和闭合性神经管畸形。NTDs致病的详细机制仍不清楚，但一致认为是遗传和环境因素相互作用的结果[1]。

众所周知，补充叶酸孕妇可以显著降低NTDs的发病风险，从开始实行叶酸强化，显著降低了NTDs的发生率[2]。目前建议所有育龄妇女在怀孕前每天服用含有0.4mg叶酸的复合维生素，对于有过患病孩子的妇女来说，建议每天补充4mg叶酸，以减少NTDs的复发风险[3]。但叶酸如何降低胎儿神经管畸形，其机制尚不清楚，研究影响叶酸新陈代谢的遗传变异可能有助于深入了解这一未知的保护机制。随着目前对单核苷酸基因多态性(Single nucleotide gene polymorphism SNP)的研究，这些代谢途径包括蛋氨酸循环、叶酸介导的一碳代谢途径和同型半胱氨酸代谢途径。通过基因多态性的检测，进一步了解NTDs和与发育相关的各种遗传标记之间的关联性，有助于增进我们对NTDs发病机理的遗传学认识。以下是参考对各自基因的基于群体的研究，选择了目前研究最热门的常见叶酸基因多态性与NTDS发病关系进行综述，以期为NTDs的机制研究提供参考。

2 5，10亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与NTDs

5，10亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase MTHFR)是目前研究最多的叶酸代谢关键酶，MTHFR酶是一种黄素蛋白，在叶酸代谢过程中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为L-5-甲基四氢叶酸，L-5-甲基四氢叶酸可以进一步进入甲基传递通路，其副产物参与同型半胱氨酸再甲基化为蛋氨酸。蛋氨酸是主要DNA甲基供体的前体，对DNA甲基化和基因调控非常重要，而甲基化又是胚胎形成和发育起着至关重要的角色。人MTHFR基因由12个外显子组成，该基因定位于1号染色体短臂末端(1p36.3)，编码70e77 kDa亚基的二聚体蛋白。MTHFR基因突变导致酶活性下降和蛋氨酸合成减少，甲硫氨酸是S-腺苷蛋氨酸(SAM)的直接前体，是参与组织发育和生长的细胞中重要的甲基供体。MTHFR基因最常见的遗传变异是677C>T多态(Rs1801133)和1298A>C多态(Rs1801131)，它们分别导致丙氨酸转化为缬氨酸和谷氨酸转化为丙氨酸。

2.1MTHFR C677T:MTHFR C677T突变是一种常见的突变，位于第4外显子，是MTHFR 677碱基对C+T替换，导致222位密码子缬氨酸转化为丙氨酸，是一种常见的降低该酶活性的多态性[4]。也是目前研究与NTDs最广泛的基因变异。MTHFR C677T多态性流行病学随地域、种族、年龄和性别的不同而不同。

Cai 等[5]对NTDs子代及健康人群进行基因检测发现，在MTHFR多态性中，母亲携带TT和CT基因型对子代NTDS的影响更大(OR=4.105，95%CI=1.271～13.258；OR=3.333，95%CI=1.068～10.400)。携带T等位基因的母亲在子代中患NTDS的风险更高(OR=1.798，95%CI=1.070～3.021)。得出MTHFR基因多态性可能是NTDS的母体危险因素。Cai等[5]对中国有NTDs生育史的母亲MTHFR C677T基因进行检测发现，携带T等位基因的母亲在子代中患NTDs的风险更高。Zhang等[6]对MTHFR基因多态性与出生缺陷和不良妊娠结局的关系进行荟萃分析发现MTHFR C677T与神经管畸形(OR=1.24；95%CI，1.08～1.42)，得出MTHFR C677T与神经管畸形相关。Nasri等[7]对突尼斯人群的基因多态性及NTDs的关系进行病例对照研究发现，MTHFR C677T是母体NTDs胎儿的保护因素，在父亲组中，MTHFR C677T是NTDs的危险因素。所有，从目前研究结果来看，MTHFR C677T基因突变与胎儿神经管畸形发生密切相关，尤其在女性人群中基因突变将直接导致下一代发生胎儿神经管畸形的概率显著升高。

2.2MTHFR A 1298C:MTHFR A 1298C 是第二个关于MTHFR多态性的研究，又叫MTHFR 1。该基因编码100 kDa烟酰胺腺嘌呤二磷酸依赖的细胞质酶，在叶酸代谢中起重要作用。MTHFD1是一种至关重要的酶，特别是在快速分裂的细胞中，如发育中的胚胎，嘌呤和嘧啶不断需要从头合成DNA。MTHFD1基因1,958位核苷酸的常见SNPs导致G到A的转变，导致酶合成酶区653位氨基酸的精氨酸到谷氨酸的替代。MTHFD1基因的表达是由一个无TATA、无启动子的启动子控制的，转录是在126bp的多个起始点启动的转录起始。MTHFD1主要位于细胞质中。甲硫氨酸循环专门定位于细胞质，是合成S-腺苷蛋氨酸(SAM)所必需的，SAM是许多转甲基化反应的甲基供体，包括组蛋白和DNA甲基转移酶(DNMTs)催化的反应。在转甲基化过程中，SAM被转化为S-腺苷-L高半胱氨酸(SAH)，SAH水解酶(SAHH)进一步将其加工成腺苷和同型半胱氨酸。Hcy通过5甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)依赖的蛋氨酸合成酶的甲基化活性被循环为Met，并可用于新一轮的SAM合成。MTHFD1的少部分存在于细胞核中，在那里它对胸苷酸的生物合成和对叶酸缺乏后的DNA损伤反应的保护是关键的[8,9]，当MTHFD1基因表达的减少可能导致可用于嘌呤和胸苷酸合成的MTHFD1酶水平降低，这种情况在胚胎发育过程中对从头合成DNA的需求增加的时候是非常有害的。

Dutta等[10]在印度东北部对医疗保健机构收治的前脑膨出的病例对照研究中证实，MTHFR 1298A>C多态性是人群中不良事件最显著的相关危险因素。与健康对照组相比，MTHFR 1298CC基因型儿童的风险高4倍。当MTHFD1多态性与MTHFR单倍型的关联时，其表现出显著的加性效应(X2=6.29,p=0.01)。Cai等[7]对突尼斯NTDs的父母与MTHFD1基因多态性进行病例对照研究发现，携带A基因型和A等位基因的母亲患NTDS的风险增加(OR=2.600，95%CI=1.227～5.529；OR=1.847，95%CI=1.047～3.259)。在Nasri等[7]的数据甚至得出突变等位基因和基因型对母亲的保护作用。在父亲组中，未发现MTHFR A1298C与NTDs的发生有关。关于MTHFR A 1298C与NTDs存在争议，且MTHFR A 1298C受种群遗传结构差异基因多态性不同，需要高质量荟萃分析进一步明确该基因在NTDS中的作用及意义。

3 蛋氨酸合成酶基因多态性与NTDs

蛋氨酸合成酶(Methionine synthase MTR或MS)是含有钴胺(维生素B12)辅助因子，催化甲基从5-甲基四氢叶酸(5-CH3-THF)转移到钴丙氨酸生成甲钴胺。它将这个甲基转移至甲基化同型半胱氨酸形成蛋氨酸，这一过程对于维持细胞内充足的四氢叶酸和蛋氨酸是必不可少的。蛋氨酸作为该途径的产物，是表观遗传机制所需的通用甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的直接前体。MTR是唯一使用5-甲基-四氢呋喃的酶，缺乏MTR或MTR活性降低会导致5-甲基-四氢呋喃的积累，不能用于叶酸依赖的反应，如参与NTDs发病的嘌呤和嘧啶的合成。因此，MTR是一碳代谢过程中所需的关键酶，是同型半胱氨酸代谢的关键，也是维持MTR处于活跃状态所必需的。人甲硫氨酸合酶基因位于染色体1q43上。它的长度为105.24 kb，由33个外显子组成。它产生约1265个氨基酸残基，重140.5 kDa，MTR一个常见多态性，位于核苷酸2756位(MTR 2756A> G)，它将天冬氨酸变成甘氨酸。研究证实MTR基因2756A>G多态性可以将天冬氨酸转化为甘氨酸[11]。

Al Farra[11]对有代表性的491人进行基因检测分析表明在整个约旦人群中MTR 2756A和MTR 2756G等位基因的总比例分别为90.73%和9.27%。约旦的MTR 2756基因型百分比分别为AA(83.5%)、AG(14.46%)、GG(2.04%)。美国的基因型分别为83.4%、15.4%和1.2%[12]，中国和韩国的不同基因型的平均百分比为 71.9%、23.3%[13]。Wang等[14]对MTR与NTDs的荟萃分析中得出MTR2756A>G与NTDS易感性相关(G与A：OR=1.45(1.06～1.98)，P=0.021；GG+AG与AA：OR=1.51(1.02～2.23)，P=0.038)。Gueant-Rodriguez等[15]对意大利40名脊柱裂儿童和58名对照组进行基因联合分析发现，MTR 2756 AG/GG、TC 777 CG/GG/MTHFR 677 CC和MTR 66 GG/MTHFR 677 CC基因型增加了儿童脊柱裂风险，OR值分别为2.6(P=0.046)、2.4(P=0.028)和4.5(P=0.023)。Ouyang等[16]荟萃分析研究结果表明MTRA66G多态性不是高加索儿童NTD风险的预测因子。Al Farra[11]对约旦17例NTDs母亲的分析结果显示这两个等位基因的多态性与NTD儿童产妇的风险增加之间没有关联。对MTR基因多态性多基于NTDs儿童患者基因检测，存在选择偏倚，对于预防NTDs发生我们需要进一步关于MTR基因多态性大样本、多中心的临床研究。

4 5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶还原酶与NTDs

5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶还原酶(Methionine synthase reductase MTRR)，是在MTR催化的再甲基化过程中，将5-甲基四氢叶酸的甲基转移到同型半胱氨酸上，在这种依赖钴胺的反应中，在活细胞中，MTR在其周期中偶尔会失活，因为每2000个周转中就有一次丙氨酸被氧化成丙胺。MTR通过将电子从NADPH转移到FAD，再转移到FMN，再转移到丙氨酸，参与MTR的还原甲基化循环。在活性MTR的再生中，还原性甲基化是由酶本身催化的，S-腺苷-L-蛋氨酸作为甲基供体，通过还原系统传递电子。在人体内，还原系统涉及如上所述的NADPH(电子供体)和MTRR(传递电子)。由于蛋氨酸的合成需要由叶酸供体进行甲基转移，因此MTRR的活性对叶酸代谢和细胞甲基化非常重要。MTRR变异等位基因已经在大约三分之一到一半的研究人群中被发现。人类MTRR基因位于染色体5p15.2-15.3。在MTRR中，位于66位核苷酸的多态性(MTRR A66G；rs1801394)可将异亮氨酸转化为蛋氨酸残基(I22M)而导致MTRR缺陷表现为降低其有效修复能力。

Wang等[14]对MTRR与NTDs的荟萃分析中得出MTRR A66G与NTDS的风险增加显著相关(G等位基因与A等位基因的比值：OR=1.36(1.03～1.80)，P=0.028；GG+AG与AA：OR=1.60(1.05～2.43),P=0.027)。Nasri等[7]对突尼斯父母MTRA66G多态性与神经管缺陷的研究中得出MTRA66G基因变异对母体NTDS有保护作用。Wilson等[17]对加拿大的一项病例对照研究表明，与对照组相比，病例和病例母亲拥有纯合子突变基因型的可能性几乎是对照组的两倍，当与低水平的钴胺联合使用时，母亲的风险增加了近5倍(优势比(OR=4.8，95%CI=1.5～15.8)；儿童合并使用这种组合的风险为2.5(95%CI 0.63～9.7)。在MTHFR和MTRR纯合子突变基因型联合存在的情况下，儿童和母亲的风险分别增加了4倍和3倍(OR=4.1，95%CI 1.0～16.4；OR=2.9，95%CI=0.58～14.8)。Quan Cai等[7]对突尼斯NTDs患者与MTRR基因多态性进行病例对照研究发现，G等位基因频率在病例组明显高于对照组(OR=1.763，95%CI=1.023～3.036)。Mohanraj 等[18]对NTDs患者胎盘与正常妊娠胎盘比较发现，在NTDs患者胎盘组织中MTRR表达异常增高(P<0.05)。从大量基础及临床研究中，我们认为MTRR基因多态性的变异可通过减少组织中的表达影响叶酸的吸收及代谢而导致后代NTDs的发生。

5 胱硫醚β合成酶基因多态性与NTDs

胱硫醚β合成酶(Cystathionine beta-synthase CBS)是一种细胞质中的同源四聚体，由551个氨基酸残基组成，是一种磷酸吡哆醛依赖性酶。在维生素B6的催化下，CBS使丝氨酸与Hcy合成胱硫醚。人类CBS基因位于染色体21q22.3上，一些CBS基因多态性被认为是遗传NTD的危险因素，如844ins68(Rs72058776)、T833C(Rs5742905)和G919A(Rs121964962)。844ins68在第8外显子插入68bp，是研究最多的与NTD相关的CBS基因多态性之一。到目前为止，已有超过191个致病性CBS突变被记录在案。这些突变中的大多数在欧洲血统的高加索人中被确认，而只有很少的来自非裔美国人或亚洲人的突变被报道。大约87%的CBS突变是错义突变，不是针对CBS催化位点，而是导致不稳定的错误折叠蛋白缺乏正常的生物学功能，指定它们进行降解。此外，相当一部分CBS突变体对作为变构活性调节剂和蛋白质稳定剂的SAM结合反应减弱。

Shaw等[19]对加利福尼亚州259名患有脊柱裂的婴儿及359名非畸形婴儿的CBS基因检测对比发现，CBS(Rs2851391)OR=2.0(1.2～3.1)；CBS(Rs234713)OR=2.9(1.3～6.7)，显示CBS与NTDs的非随机相关性的统计学证据。Houcher等[20]对阿尔及利亚NTDs有生育史的母亲的CBS基因多态性的杂合基因型频率与母亲对照组相比有统计学差异(OR：3.72；95%CI：1.59～8.73)。Harris MJ[21]在动物实验中发现CBS突变体小鼠神经管闭合正常。Ouyang S等[22]对CBS与NTDs的相关风险进行荟萃分析发现，母亲、儿童和父亲中CBS 844ins68多态性与NTD风险之间均无显着相关性，得出CBS 844ins68多态性不是NTD风险的良好预测指标。R Zhao等[23]在NTDs母亲和非NTDs母亲之间在CBS基因中T833-C和G919-A突变的频率方面没有发现显著差异。

关于CBS多态性变异与NTDs的基因多态性的研究中，研究的结果是相互矛盾的，导致这些多态性的临床意义还不确定。分析原因是我们无法量化基因-环境和基因-基因的相互作用的影响，一些单核苷酸多态性的影响可以归类为“不相关”，并进一步得出结论，其实它们在NTDs的发病风险可能没有主效应，或者只具有与其他单核苷酸多态性相互作用的微乎其微的效应，导致NTDs的发生。建议在更详细的分层和更大的人群基础上进行进一步的研究，以研究CBS与NTDs的相关多态性。

6 甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶基因多态性与NTDs

甜菜碱-同型半胱氨酸S-甲基转移酶(betaine-homocysteine methyltransferase BHMT)以甜菜碱为甲基供体底物将同型半胱氨酸转化为蛋氨酸。BHMT的四级结构为二聚体。对于每个单体，其中包含酶的活性位点和催化锌位点。人类BHMT基因已被定位于染色体5q13.1-q15.2，分别由8个外显子和7个内含子组成。人类BHMT基因可能产生比野生型更高的同型半胱氨酸亲和力的酶。这种多态性可能在同型半胱氨酸的稳态中起关键作用。BHMT基因多态性还可能产生一种高效的变异，当与高叶酸水平结合时，这种变异会导致代谢周期过度运转。在对照样本中描述的等位基因频率在美国是0.25～0.33，在加拿大是0.31，在波兰是0.28和0.29，在罗马尼亚是0.30，在中国是0.30，在荷兰是0.31[24]。

王懿征等[25]对中国北方汉族儿童BHMT基因分型，结果BHMT基因rs3733890位点等位基因频率与NTDs的发病存在显著关联，且携带A等位基因儿童发生NTDs风险高于G等位基因的儿童(OR=I.408，95%CI=1.013—1.95)。证明BHMT基因多态性与儿童NTDS易感性显著相关。Cao等[26]在中国对 152名患有NTD的儿童进行了病例对照研究。结果证明NTD和BHMT基因中rs3733890的等位基因频率有统计学差异(P = 0.041)，而A等位基因的患儿NTD的风险高于G等位基因(OR = 1.408，95%CI =1.013～1.956)。单倍型分析显示BHMT的CAAA单倍型与NTD风险增加相关，但BHMT的CGAA单倍型可能降低NTD的风险。Shaw等[19]关于BHMT与NTDs的病例对照研究中，得出OR = 1.8(1.1～3.1)，证明BHMT与NTDS相关。特别是当母亲服用未孕的叶酸或父母优先传递MTHFR rs1801133 T等位基因时，BHMT与NTDs显著相关。BHMT与NTDs的关系得到证实，但目前对该基因在NTDs的作用机制上有更加深入的研究，但在临床上，通过加强监测备孕妇女的BHMT的基因多态性从而指导临床补充叶酸的非常有必要的。

7 二氢叶酸还原酶基因多态性与NTDs

二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate Reductase DHFR)将胸苷酸合成过程中形成的二氢叶酸还原为四氢叶酸，从而刺激叶酸周转，产生dTMP，进而合成DNA。这些过程对于细胞的快速生长和分裂都是必不可少的。充足的叶酸周转对于DNA、RNA和蛋白质的适当甲基化都很重要。人类dhfr基因位于5q11.2，跨度超过30kb。一种常见的DHFR多态性包括位于内含子-1中19bp的缺失，该缺失位于DNA序列的非编码部分，与调节DHFR的转录和翻译有关，与脊柱畸形发生的风险相关，对胚胎发育至关重要，这可能是通过改变DHFR基因的表达来实现的[27]。

Johnson等[28]对脊柱裂家族成员及对照组人群提取DNA，分析DHFR内含子-1的19bp缺失多态性，结果显示对照个体的基因型频率与SB脊柱裂母亲的基因型频率差异有统计学意义(P=0.032)，但与脊柱裂患者及父亲的基因型频率无显著性差异(P>0.05)。脊柱裂母亲与对照组不同，缺失等位基因纯合子的频率增加，而杂合子的频率下降。Paul 等[29]对62名NTDS胎儿的母亲及73名健康婴儿的母亲的DHFR基因进行检测，病例组野生等位基因频率为63%，对照组为58%。病例组和对照组缺失等位基因频率分别为37%和42%。病例组和对照组纯合子+/+基因型频率分别为41.94%和34.25%，杂合子+/-频率分别为41.94%和47.95%。病例组-/-基因型频率为16.13%，对照组为17.80%。通过共显性、显性和隐性模型，发现DHFR对NTDs风险不显著。Prasoona等[30]通过采用以家族为基础的三联体研究设计，对来自印度泰兰加纳的124例NTD患者-父母三组(n=124x3=372)和184例健康对照-父母三组(n=184x3=552)进行DHFR 19bp缺失基因分型。证实了母体DHFR19bp缺失对胎儿无脑发育的强烈影响。母亲缺失基因型(DD)和父亲杂合缺失基因型(WD)的交互作用与神经管畸形的风险相关，提示在神经管畸形的病因研究中应同时考虑父亲的遗传效应和母体的遗传效应。杂合缺失基因型(WD)患者父母的血清叶酸水平明显高于对照父母(P<0.05)。基因杂合缺失基因型(WD)患者的血清叶酸水平明显高于对照父母。得出DHFR 19bp缺失可作为预测神经管畸形病因学预后的生物标志物。

8 总 结

NTDs是一种复杂的疾病，叶酸代谢相关基因多态性是导致基因功能或调控改变的DNA序列变异，直接导致疾病过程。然而，大多数叶酸代谢相关基因多态性可能对疾病的发病作用不大。于标记叶酸代谢相关基因多态性与实际功能叶酸代谢相关基因多态性之间的关联性，它们作为遗传标记可用于寻找功能性叶酸代谢相关基因多态性，编码每种酶的基因的多态性与改变每种蛋白质的一级结构有关。未来旨在确定这些危险因素的研究必须以更广泛的视角来处理这个问题，包括几个基因，并收集尽可能多的环境数据。尽管有大量的临床数据将NTDs与叶酸基因联系起来，叶酸在NTDs病因中的作用可能源于表观遗传效应或与非叶酸基因的相互作用。所有的研究都支持NTDs的多因素性质，强调了多种方法的必要性，以便理清导致这种复杂疾病的因素。