脂肪源性干细胞在慢性创面愈合中的作用及研究进展

黄海燕，李展鹏，吴泽勇，廖思牡，吴志远（审校）

（广东医科大学附属医院整形外科，广东 湛江，524000）

慢性创面亦称慢性伤口、难愈性创面，一般认为由各种原因引起的，经正规治疗超过4周仍未愈合或没有愈合趋势的创面[1]。慢性创面病程冗长，常引起严重功能障碍，对患者及患者家庭的正常生活造成严重干扰，慢性创面患者多数为中老年人，随着人口老龄化，其发生率呈日益增长趋势。根据我国流行病学研究，2011年住院患者中慢性创面发生率已达1.7‰[2]。目前，我国每年慢性难愈合创面的治疗需求在3000万人次，而整个创面治疗需求高达1亿人次[3]。糖尿病足是形成慢性创面的主要病因之一，我国50岁以上的糖尿病患者糖尿病足的发病率高达8.1%，糖尿病的发生率从1986年的0.67%上升至2020年的11.2%[4]，预计到2030年全球患病人数将达到5.78亿人，到2045年升至7亿[5]。慢性创面已俨然成为一个严重的全球健康问题。由于其形成机制复杂，影响因素众多，根据病因的不同，临床上主要分为：创伤性溃疡、压迫性溃疡、糖尿病溃疡、静脉性溃疡、缺血性溃疡，另外还包括感染性溃疡、神经性溃疡、放射性溃疡等类型[6]。

慢性创面的传统治疗方法包括创面保守清洁换药、抗生素局部或全身应用、各种物理疗法、创面允许时进行外科手术治疗等。近年来，国内外许多学者通过对影响创面愈合因素及促进创面愈合机制的深入研究陆续推出新的治疗理念和方法，如在换药基础上联合各种新型敷料及生长因子、亦或者联合富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、人工真皮、创面负压封闭治疗等，但仍然难以获得令人满意的愈合效果，且慢性创面常伴有感染，可导致脓毒症等并发症，严重可对患者生命造成威胁。一种被认为特别有前景的治疗策略是利用脂肪源性干细胞（adiposederived stem cells，ADSCs）。相比较于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，ADSCs不仅具有相似的基因结构以及相同的分化潜能，能表达相同的表面标志物，且来源广泛、含量较多、获取方式简单、患者承受的痛苦也较少，被认为是BMSCs的替代来源[7]。本文旨在概述ADSCs的特性以及其治疗慢性创面的作用机制、基础研究及可能的临床应用。

1 ADSCs

脂肪组织被认为是一种能量调节组织，主要由脂肪细胞组成，除此之外，还包括前脂肪细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和多种免疫细胞。ADSCs来源于脂肪组织，最早于2001年被Zuk[8]首次从脂肪抽吸物中分离出来，随后逐渐被发现具有自我更新能力、多重分化潜能，并具有许多重要生长因子的旁分泌功能[9]。由于人体脂肪组织分布广泛，来源丰富，因而ADSCs可以从人体脂肪组织中大量分离出来，且供体发病率低，低温沉淀可保存六个月以上[10]。目前临床上获得ADSCs的两种最重要的方法是抽脂术和脂肪切除术。相关研究[11]认为抽脂术所使用的局部肿胀麻醉液是导致自体脂肪移植后出现局部坏死、液化和纤维化，存活率较低的关键因素。Bian等[12]从细胞形态、生长动力学、功能等方面比较抽脂术和脂肪切除术所获取的ADSCs的生物学特性，结果显示，与抽脂所得的ADSCs相比，脂肪切除术所得ADSCs具有更好的生物学特性。通过不同浓度的利多卡因和肾上腺素处理细胞，显示其对ADSCs的细胞毒性呈剂量依赖性，降低了ADSCs的活力。获取脂肪组织片段后，最广泛使用的分离方法是胶原酶消化，其次是离心。最后，将分离的ADSCs在常规培养条件下进行增殖，为了获得纯化的ADSCs，通常需进行传代培养。

ADSCs的特性需要满足免疫非典型和分化能力标准,国际细胞治疗协会(ISCT)和国际脂肪治疗与科学联合会(IFATS)指定了定义ADSCs的三个最低标准：(1)细胞可黏附性；(2)必须表达CD73、CD90、CD105，缺乏CD14、CD11b、CD45、CD19、CD79和人白细胞抗原-dr (HLA-DR)的表达；(3)必须具有分化为前脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的潜力[13]。

由于ADSCs的多功能性，使其在组织工程和器官再生的应用中越来越受到重视。近年来，相关学者将ADSCs作为再生治疗中的新临床应用，研究包括骨再生、软骨再生、神经系统修复、肝脏再生、心肌修复、皮肤创面愈合等领域均有令人惊喜的发现[14]。以骨再生为例，Zhang等[15]将ADSCs注射到小鼠骨折部位及周围肌肉内，与对照组相比，ADSCs治疗增加了骨痂骨膜区域的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达、胶原向矿化骨痂的重塑和骨强度。通过增加生长因子的产生刺激血管生成和ADSCs向成骨细胞分化，从而形成新骨并加速骨折修复。

2 ADSCs 在创伤愈合中的作用机制

2.1 增加胶原分泌和沉积

临床前研究[16]表明，ADSCs通过调节细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白的mRNA水平，增强人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)中I型胶原的分泌，上调I型胶原、III型胶原和纤连蛋白，下调MMP-1从而促进皮肤创面愈合。Zhou等[17]通过体内实验证明，与单纯注射PBS的小鼠相比，由ADSCs产生的ECM可以更快地促进创面愈合以及I型和III型胶原的表达增加，从而验证了ADSCs对皮肤创面愈合的积极作用。Shen等[18]利用人ADSCs、壳聚糖支架（PLGA）构建的人工真皮修复链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠创面中发现与单独使用支架或不使用支架治疗的创面相比，ADSCs/PLGA人工真皮可通过促进血管生成生长因子和真皮胶原合成从而有效促进糖尿病创面愈合。此外，ADSCs不仅能增强成纤维细胞的迁移和增殖，还能抑制增生性瘢痕成纤维细胞中胶原沉积和α-平滑肌肌动蛋白的表达[19]。

2.2 促进上皮化

作为具有分化潜能的干细胞，ADSCs具有上皮化的潜能。Kim等[16]通过体外创面愈合模型得到ADSCs对HDF的迁移具有促进作用。在此基础上，他们利用动物实验验证了ADSCs能显著减小创面的大小，加速创面边缘的再上皮化从而促进创面愈合。Altman等[20]研究发现，人ADSCs通过分化为表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞促进小鼠皮肤全层缺损创面的上皮化。Ebrahimian等人[21]将ADSCs注入未辐照和辐照小鼠的皮肤穿孔创面。第14天时发现ADSCs促进辐照和未辐照小鼠皮肤创面愈合，增强创面闭合、黏性和胶原组织分泌。另外，ADSCs在体内与真皮和表皮组织结合，表达表皮标记物K5和K14。在角质形成细胞培养基中培养的ADSCs可分化为K5和k14阳性细胞，并产生高水平的角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)。因此得出ADSCs可通过促进再上皮化参与生理和病理条件下的皮肤创面愈合。

2.3 促新生血管生成

创面内毛细血管的新生是创面愈合或缺血修复过程中必不可少的一步，组织再生需要流动的血液提供氧气和营养并清除废物，充足的血液可以改善局部微循环、减少感染发生。在成人中，血管发生和血管新生同时发生，而VEGF和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)在血管生成因子中起着关键作用[22]。Li等人通过实验证明在缺血环境下，ADSCs介导后产生的细胞因子通过诱导血管生成促进创面血供恢复[23]。同样的，Justyna等利用小鼠后肢缺血模型进行实验，研究表明，ADSCs促进了浸润性巨噬细胞的形态变化及其与血管形成的紧密联系。将ADSCs注入缺血肌肉会影响浸润细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等）的分布，这些细胞参与血管形成的每个步骤，促进有效的缺血组织新生血管[24]。Mendez等人开发了一种纤维蛋白配方，允许ADSCs在体外形成管状结构，此结构可表达内皮细胞标记物，包括CD31、血管内皮细胞钙黏蛋白以及周细胞标记物NG2。通过评估创面大小、肉芽组织数量和胶原蛋白含量得出ADSCs在硬纤维蛋白凝胶中形成血管，使创面更快愈合[25]。

2.4 免疫调节

炎症期的延长是慢性创面形成的一个重要因素，持续的炎症期会引起炎症细胞因子的异常分泌，如中性粒细胞增多；另外，基质金属蛋白酶（matrix Metalloproteinases，MMPs）分泌的增多及促进创面愈合的重要因子的减少加速了细胞外基质的降解。我们已经知道ADSCs的旁分泌作用可以分泌大量细胞因子，而研究[26]表明，这些细胞因子可以增强ADSCs的血管生成和抗炎因子的分泌。在由叶酸诱导的肾毒性小鼠模型中，接受ADSCs治疗的小鼠在治疗24小时后表现为血清尿素降低，提示肾功能改善。这些数据通过减少趋化因子表达和减少中性粒细胞浸润与细胞周期调节和免疫反应调节相关。且长达4周的分析表明，ADSCs治疗通过减少间质胶原沉积、组织趋化因子和细胞因子的表达证明了肾纤维化和慢性炎症的减少。因此得出ADSCs治疗通过调节炎症和细胞周期在肾毒性损伤小鼠模型中发挥减少肾损伤、改善肾功能，抑制器官纤维化并提供长期免疫调节的保护作用[27]。

3 ADSCs 应用于慢性创面的基础研究

Strong等[28]利用小鼠压疮创面模拟人类压疮状况，应用同种异体鼠ADSCs进行治疗时显示创面闭合速度增快以及明显组织学改善。Hamada等[29]利用大鼠建立头部骨外露模型，取大鼠自身脂肪组织制备ADSCs，分组植入或不植入ADSCs的人工真皮覆盖后进行观察，结果显示ADSCs治疗组创面面积缩小速度、创面血管密度及FGF、VEGF表达水平均高于对照组。Kuo等[30]将体外培养的ADSCs局部注射至链霉素诱导的糖尿病小鼠的创面边缘，结果显示ADSCs治疗组创面愈合时间较对照组明显缩短，且有效降低炎症反应，促进新生血管生成和组织再生。Cooker等[31]将ADSCs应用在缺血性创面的小鼠上，观察划痕实验结果和创面愈合情况。结果显示，ADSCs外泌体可促进成纤维细胞迁移，实验组小鼠的创面愈合速度较对照组明显增快。

ADSCs联合生物支架应用于创面也是组织工程用于修复损伤的常用方法。Nambu等[32]将自体ADSCs联合胶原支架应用于有愈合缺陷的糖尿病db/bd小鼠背部皮肤创面，结果与对照组相比，ADSCs可通过分泌具有生物活性的bFGF、VEGF、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor,PDGF）、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)促进再上皮化、毛细血管形成和肉芽组织增生进而加速创面愈合。Shen等[18]将ADSCs接种在聚乙烯-壳聚糖支架中作为人工真皮修复糖尿病创面，发现其能有效加速创面愈合。Tyeb[33]等人将ADSCs注入涂有层粘连蛋白的抗氧化明胶-丝胶(GS)支架上应用于糖尿病创面大鼠模型，最后验证结果表明，GSL-ADSCs在苏木精和伊红、Masson等染色中与其他对照组相比较具有更好的创面组织再生和胶原重塑能力，且免疫组化CD31染色显示血管新生增强。此外，近期有学者利用3D生物技术打印了一种高效的载ADSCs和一氧化氮（NO）的水凝胶支架（3D ADSCs/NO）应用于严重烧伤创面。通过小鼠烧伤创面模型实验表明，3D-ADSCs/NO通过促进上皮化和胶原沉积加快创面愈合。由于3D生物系统中ADSC中VEGF-mRNA的上调致使CD31免疫组织化学显示新生血管增多。这些发现表明3D-ADSC/NO水凝胶支架可通过VEGF信号通路增加新生血管，从而促进严重烧伤创面愈合[34]。

除支架材料外，细胞膜片同样是近年兴起的一种组织工程新技术。Cerqueira等[35]使用人ADSCs薄片移植到具有延迟愈合的全层切除小鼠皮肤伤口中。实验发现，此细胞薄片可以促进小鼠创面的神经血管化和上皮形成，创面愈合速度较对照组明显增快。Rezapour-Lactoee等[36]将ADSCs在体外条件下置于热响应性敷料膜表面使其生长，随后把带有其分泌的ECM细胞薄片转移到受损皮肤上。结果显示ADSCs治疗组的伤口闭合率较高。对于这组大鼠，根据组织学和免疫组化分析结果表明，其新表皮长度，再上皮化层厚度，新生血管和毛细血管密度均明显优于对照组。此外，ADSCs联合PRP也已被证实具有协同促进作用，Ni等[37]将ADSCs联合PRP应用于SD大鼠背部糖尿病创面模型，实验结果表明，与ADSCs、PRP和阴性对照组相比，ADSCPRP组VEGF、p-STAT3、SDF-1表达水平更高，创面愈合速度更快。ADSCs与PRP联合处理可强烈刺激内皮细胞增殖从而促进创面新生血管形成。

4 ADSCs 促进慢性创面愈合的临床应用

随着ADSCs治疗创面机制研究的进展及提取技术的成熟，ADSCs应用于慢性创面的治疗研究逐渐向临床转化。Lee等[38]进行了一项初步研究，利用ADSCs对15例患有严重肢体缺血的患者进行多点肌内注射，在长达六个月的随访时间内无并发症出现。66.7%（10例）的患者出现了临床改善，包括疼痛评分和跛行行走距离。此外，ADSCs应用前及应用后6个月数字减影血管造影显示有大量的血管侧支网形成。因此他们认为，对于其他治疗方式难以治疗的肢体缺血患者，多次肌内注射ADSCs可能是一种安全的选择。另一项类似的研究来源于Bura等学者[39]招募了7名非血管重建性肢体缺血(CLI)患者，抽取腹部脂肪培养ADSCs并将其肌肉注射到患者缺血腿部，同样无并发症出现。结果提示大多数患者溃疡演变和创面愈合均有改善，且经皮氧压有增加趋势。Stasch等[40]对26例下肢慢性创面的患者进行手术清创和自体脂肪移植，25处创面中有22处在平均68.0±33.0天内完全愈合。平均4周后，创面大小减少了50%，此方法为其他介入治疗失败的糖尿病足和有外周血管疾病背景的下肢慢性创面提供了一种简单而有用的选择。Piccolo等[41]通过科尔曼技术使用脂肪移植辅助治疗烧伤创面、静脉溃疡、糖尿病溃疡，证明了注射到疤痕下的脂肪、注射到伤口下、伤口周围和骨折线或空间内的脂肪以及沉积在伤口上的脂肪的再生效果。上述研究尽管在研究设计、基础条件及应用方法等方面存在显著差异，但均显示ADSC是安全的，有促进慢性创面愈合并减轻疼痛的潜力。总体而言，目前大多数临床试验处于早期阶段，且样本量较小，ADSCs应用于慢性创面的安全性及有效性仍需大样本量临床应用进一步验证。

5 问题及展望

本综述所包括的研究均表明ADSCs在慢性创面愈合中具有良好的治疗潜力。但仍存在一些问题，譬如目前较多的研究来自于动物模型，而鼠、兔等实验动物与人体有明显差异，如何构造与人体结构更为相似的动物模型有待进一步研究；虽然脂肪组织分布较广，获取方法简便且损伤小，但存活率不高，随着对脂肪机制的深入了解，研究者利用物理方法去除脂肪细胞，留下作用于创面修复的高浓度血管基质成分如纳米脂肪(Nanofat)、血管基质成分凝胶(SVF-gel)，并且通过临床应用发现均有效促进慢性创面愈合，但样本量同样较少，且目前尚未见其与直接利用ADSCs对比的相关报道，无法明确通过物理方法获取的脂肪衍生物是否对慢性创面有更好的临床效果；另外，慢性创面主要威胁伴有糖尿病等慢性病的中老年人，由于糖尿病持续存在的高血糖和糖基化产物使ADSCs分泌功能受损，从而影响ADSCs附着及增殖能力，导致其对创面的作用减弱，因此，糖尿病ADSCs功能受损的机制及同种异体ADSCs移植也是今后探讨的方向；还有，由于ADSCs具有自我复制及多向分化潜能，与肿瘤细胞特性相似，尽管目前的基础及临床应用暂未发现其与肿瘤的发生相关，也没有明确的研究证据表明其无致瘤性，仍有待进一步证实。

综上所述，目前ADSCs在治疗慢性创面上已经取得了一定的成果，但包括ADSCs促进创面愈合的机制、ADSCs的获取及移植、达到治疗效果时ADSCs的所需量以及慢性创面的治疗方式选择等均未达成共识，这是未来的研究方向。总而言之，ADSCs在治疗慢性创面上的潜能毋庸置疑，我们静候其佳音。