中药成分辛弗林对胶体金免疫层析法检测β-受体激动剂的影响

王子琳，唐子恒，林泽宁，刘文字，刘 戎，张嘉慧，沈祥广*

(1.华南农业大学 国家兽药残留基准实验室，广州 510642；2.农业农村部畜禽产品质量监督检验测试中心(广州)，广州 510642)

β-受体激动剂引起的食品安全问题是全世界关注的热点。在食品动物饲养中，由于高剂量的β-受体激动剂可以加快脂肪的分解，提高动物的瘦肉率[1-2]，个别厂家非法将其添加至饲料中来提高食品动物的经济效益[3]。如今，β-受体激动剂作为促生长剂已在全球大约160个国家被禁止使用，包括中国、俄罗斯和部分欧洲国家等[4]。胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assay,CGIA)具有方便、易操作、低成本、适用性强等特点[5]，因此常用于检测动物组织或尿液中克伦特罗(clenbuterol，CLE)、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)和莱克多巴胺(ractopamine,RAC)3种β-受体激动剂(下文称3种β-受体激动剂)等化合物，以确保动物源性食品的质量安全。

在国家倡导减抗养殖的背景下，许多养殖场会使用中兽药粉末或中药制剂进行疾病防控。例如在猪的饲料中添加杜仲、党参、陈皮等中药粉具有促进猪只生长、增强免疫功能、提高酮体性能等方面作用[6-9]。在使用CGIA法检测3种β-受体激动剂的过程中，有时会出现CGIA检测呈阳性(即CLE、RAC、SAL至少有1种检测呈阳性)，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)复测时呈现未检出的结果，即假阳性现象，针对这一现象的解释和研究较少。笔者在前期试验中发现，105种中药材中，陈皮、青皮、木瓜、厚朴、红景天5种中药的提取物β-受体激动剂CGIA检测呈阳性，而在中药饲喂动物试验中，仅有饲喂了陈皮、青皮2种中药后的猪尿液CGIA检测出现RAC阳性反应。阳性猪尿经LC-MS/MS复测，未检出RAC[10]。陈皮和青皮均含有一个中药成分—辛弗林(synephrine，SYN)，可能是引起猪只尿液CGIA检测3种β-受体激动剂出现假阳性的关键成分。为进一步验证陈皮、青皮、木瓜、厚朴、红景天5种中药对CGIA法检测β-受体激动剂的影响，本试验采用LC-MS/MS法和小鼠肝微粒体体外模型，研究辛弗林对CGIA法检测3种β-受体激动剂的影响，以期为兽医临床合理使用中药提供参考，减少由中药源引起的“瘦肉精”CGIA 检测假阳性现象的发生。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

辛弗林标准品购于上海源叶生物科技有限公司。受试中药购于广州南北行中药饮片有限公司。甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。小鼠肝微粒体(ICR/CD1)购于瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司。CLE、RAC、SAL 3种胶体金免疫层析检测卡购于北京勤邦生物科技有限公司。液相色谱串联质谱仪，型号Agilent 1290 Infinity Ⅱ搭配Agilent 6470 Triple Quad LC/MS，购于美国安捷伦科技有限公司。

1.2 溶液及配制

辛弗林标准储备液：精密称取5.10 mg辛弗林标准品(98%)，置于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为1 mg·mL-1的辛弗林储备液，-20 ℃保存；储备液使用前以超纯水稀释成不同浓度的辛弗林标准工作液，4 ℃保存。PBS缓冲液(pH=7.4)：取磷酸二氢钾1.36 g，加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液79 mL，用纯水稀释至200 mL。100单位六磷酸葡萄糖脱氢酶：取0.41 mg六磷酸葡萄糖脱氢酶(241 U·mg-1)，用5 mmol·L-1柠檬酸钠溶液定容至2.5 mL，-80 ℃保存。co-factors溶液：取200 mg NADP+，200 mg六磷酸葡萄糖，133 mg氯化镁，用双蒸水定容至10 mL，-20 ℃下保存。

1.3 液相色谱串联质谱法检测中药提取复溶液和猪尿中的辛弗林

1.3.1 猪尿中辛弗林的测定

1.3.1.1 液相色谱及质谱条件:

a)色谱条件 色谱柱：Luna C18(2)(150 mm × 2.0 mm，5 μm)；流速：0.25 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。流动相：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Mobile phase elution gradient

表2 辛弗林的质谱分析参数Table 2 Mass spectrometric analysis parameters of synephrine

1.3.1.2 猪尿样品前处理:取猪尿0.5 mL，加入乙腈9.5 mL，涡旋1 min，密闭，40 ℃水浴超声30 min，2 800×g离心5 min，取离心后的上清液5 mL，氮吹至干，取0.5 mL流动相复溶，过0.22 μm微孔滤膜，进液相色谱-串联质谱仪检测。

1.3.1.3 基质匹配标准曲线和线性范围:取空白猪尿，按上述步骤前处理获得的空白猪尿基质，将标准工作液稀释成不同浓度，绘制基质匹配标准曲线，求出回归方程和相关系数。

1.3.1.4 回收率和变异系数：移取空白猪尿0.5 mL若干份，分别加入浓度为0.5、2.5和5.0 μg·mL-1的辛弗林标准工作液100 μL，制成添加浓度为0.1、0.5和1.0 μg·mL-1的空白添加样品。按“1.3.1.2”方法处理，重复3批，计算回收率和变异系数。

1.3.1.5 测定：取饲喂中药后CGIA检测β-受体激动剂呈阳性的猪尿样品6份，该猪尿为前期动物饲喂试验中对105种中药进行筛查获得的饲喂了陈皮和青皮的猪尿；陈皮和青皮按每只猪每天50 g的使用量(约为《中华人民共和国兽药典》推荐剂量的5倍)，连续给药3 d，于给药后约6 h接取的猪尿。取猪尿0.5 mL，按“1.3.1.2”方法处理，进液相色谱-串联质谱仪分析辛弗林含量。采用外标法，以基质匹配标准曲线方程定量。

1.3.2 中药提取复溶液中的辛弗林含量测定 精密量取100 μg·mL-1辛弗林标准工作液适量，用流动相稀释成不同浓度的标准溶液，每个浓度3个重复，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。

分别取陈皮、青皮、木瓜、厚朴、红景天5种中药粉末2 g，各作3个平行样。加乙醇-乙腈(1∶9，v/v)10 mL提取并浓缩[10]，复溶液过滤后用流动相稀释，进液相色谱-串联质谱分析辛弗林含量。采用外标法，以标准曲线方程定量，测定中药提取复溶液中辛弗林的浓度。

1.4 小鼠肝微粒体对中药CGIA检测阳性成分的影响

出现假阳性的中药提取复溶液以双蒸水稀释至CGIA检测RAC呈阳性临界浓度的10倍，备用。辛弗林添加阳性样品：取CGIA法检测β-受体激动剂呈阴性的2种中药复溶液，分别添加适量辛弗林标准工作液(PBS稀释)，用双蒸水稀释至CGIA检测RAC呈阳性临界浓度的10倍，备用。

将小鼠肝微粒体置37 ℃水浴解冻。于2 mL EP管中，将640 μL双蒸水、100 μL PBS缓冲液(pH=7.4)、100 μL备用液和100 μL小鼠肝微粒体混合(反应体系中的蛋白浓度为2 mg·mL-1)，置37 ℃水浴预孵育3 min后，分别加入10 μL 100单位六磷酸葡萄糖脱氢酶溶液和50 μL co-factors溶液，启动反应，继续置37 ℃水浴中孵育。在启动反应后的0、1、2、3、4、5、6 h取样进行胶体金免疫层析检测。每组3个平行。

对照试验：取100 μL PBS缓冲液代替备用液，与640 μL双蒸水、100 μLPBS缓冲液和100 μL小鼠肝微粒体混合制成不含中药的对照；取100 μL 重悬缓冲液代替小鼠肝微粒体，与640 μL双蒸水，100 μL PBS缓冲液和100 μL 备用液混合制成不含肝微粒体的对照。

2 结 果

2.1 辛弗林液相色谱串联质谱检测法的建立

2.1.1 标准曲线和线性范围 空白猪尿基质匹配标准曲线在线性范围10～1 000 ng·mL-1，相关系数(r)为0.999 5，线性关系良好。

2.1.2 回收率和变异系数 在0.1、0.5和1.0 μg·mL-13个添加浓度水平，猪尿中辛弗林的回收率为72.3%～95.0%，批内变异系数为2.5%～12.6%，批间变异系数为7.3%～13.8%。

2.2 CGIA检测阳性样品的辛弗林含量测定

当PBS中辛弗林浓度为0.8 μg·mL-1时，β-受 体激动剂CGIA检测仍呈阳性反应(RAC阳性)，进一步稀释呈阴性；取多份 CGIA 检测阴性的猪尿添加辛弗林标准工作液，制成含不同浓度的辛弗林添加猪尿，进行 CGIA 检测，结果发现，当猪尿中辛弗林浓度为 0.2 μg·mL-1时，RAC仍呈阳性反应，进一步稀释呈阴性。

液相色谱-串联质谱法分析结果表明，饲喂了陈皮和青皮的猪尿液均检出了辛弗林，平均浓度分别为1.36和1.65 μg·mL-1，饲喂厚朴、木瓜和红景天的猪只尿液未检出辛弗林。在陈皮和青皮的提取复溶液中，辛弗林的平均浓度分别为132.6 和312.7 μg·mL-1；而在厚朴、木瓜和红景天3种中药的提取复溶液中均未检出辛弗林。

2.3 CGIA检测阳性的中药复溶液与小鼠肝微粒体的孵育结果

木瓜、厚朴复溶液和小鼠肝微粒体混合反应后，0、1 h的CGIA检测呈RAC阳性结果，2～6 h的CGIA检测结果为RAC逐渐转为阴性。陈皮、青皮复溶液和小鼠肝微粒体混合后，0～6 h 的CGIA检测结果均呈RAC阳性。

阴性中药木香和山药的复溶液制备的辛弗林添加阳性样品与小鼠肝微粒体混合反应后，0～6 h的CGIA检测结果均为RAC阳性。木香和山药的复溶液经肝微粒体孵育后，0～6 h的CGIA检测均呈阴性。

对照试验的结果：不含中药对照试验样液0～6 h CGIA检测均呈阴性；不含肝微粒体的假阳性中药对照试验样液0～6 h的CGIA检测均呈阳性。

红景天的提取复溶液用双蒸水稀释5倍后即显阴性，在体系中无法达到CGIA检测灵敏度，未进一步测试。

3 讨 论

3.1 辛弗林引起的CGIA检测β-受体激动剂假阳性

特异性单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高等特点，并被广泛应用至胶体金免疫层析试纸条的制作上，试纸条检测的特异性也依赖于单克隆抗体的识别[11]。试验中使用的胶体金免疫层析检测卡为专门检测猪尿中CLE、RAC和SAL的试纸条，其在设计时可能是主要以猪尿为抗原和抗体的生理液基质进行开发，这可能是辛弗林在PBS缓冲液中和在猪尿中CGIA检测灵敏度不同的原因。

辛弗林，又称脱氧肾上腺素，是一种存在于陈皮、青皮等柑橘类植物果实的中药成分，具有加速体内脂肪氧化等作用，如图1所示，其分子结构与RAC较为接近，针对RAC的单克隆抗体可能会误识别辛弗林为目标抗原并与之结合，从而出现CGIA检测β-受体激动剂假阳性的现象。

图1 沙丁胺醇(a)、克伦特罗(b)、莱克多巴胺(c)、辛弗林(d)结构式对比Fig.1 Structure comparison of salbutamol(a),clenbuterol(b),ractopamine(c)and synephrine(d)

试验中，采用液相色谱-串联质谱法分析，陈皮和青皮的提取复溶液以及饲喂猪收集的尿液均能检出辛弗林，且浓度均高于CGIA的检测低限，而木瓜、厚朴、红景天的提取复溶液以及饲喂猪收集的尿液均未检出辛弗林。试验结果表明，中药成分辛弗林能引起CGIA检测RAC显假阳性，而木瓜、厚朴、红景天提取物中引起CGIA检测β-受体激动剂显假阳性的成分并非辛弗林，具体的成分确证仍需进一步研究。

3.2 体外模型中小鼠肝微粒体对中药CGIA检测阳性成分代谢

与化学合成药物不同，中药的成分较多，与机体的相互作用较复杂[12]，同一种中药，不同产地、生长时间等因素都会影响成分的变化。采用小鼠肝微粒体体外模型，可以研究动物机体的肝酶系统对药物的代谢作用。陈皮、青皮、木瓜、厚朴、红景天5种中药虽然直接提取CGIA检测均呈阳性，但引起假阳性的成分可能不同。试验中显示，木瓜和厚朴的假阳性干扰成分能被小鼠肝微粒体代谢成非阳性物质，提示该2种中药的阳性成分可能在动物体内被代谢，猪尿显阴性；而红景天的假阳性成分可能是浓度或活性较低，在猪尿中未达到有效检测浓度。在木瓜、厚朴、红景天3种中药中，引起β-受体激动剂CGIA检测的化学物质鉴定有待进一步探索；中药成分辛弗林难以被小鼠肝微粒体代谢，提示陈皮和青皮中的辛弗林成分被动物吸收后在尿中形成较高浓度，导致CGIA检测β-受体激动剂出现假阳性。

4 结 论

猪饲喂陈皮和青皮后引起猪尿CGIA检测β-受体激动剂出现假阳性与陈皮和青皮中含有的中药辛弗林成分有关。陈皮、青皮、厚朴、木瓜和红景天5种中药均含有CGIA检测β-受体激动剂假阳性成分，但仅陈皮和青皮含有辛弗林。厚朴和木瓜的假阳性成分可被小鼠微粒体代谢消除，陈皮和青皮中含有的假阳性成分辛弗林难以被小鼠微粒体代谢消除。