安肠愈疡汤对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障的修复作用及机制研究*

孙大娟，王晗潞，王帅，迟莉丽

（1．山东中医药大学附属医院脾胃病科，济南 250000；2．山东中医药大学第一临床医学院，济南 250000）

溃疡性结肠炎（UC）是一种涉及感染、免疫、遗传等多因素的慢性非特异性炎症性肠病[1]。近20年来，中国UC的发病率急剧增加[2]，但其发病机制仍未完全阐明，目前认为肠黏膜屏障功能受损是其重要病理改变，与疾病的发生发展密切相关[3]，故维护肠黏膜屏障的完整性和通透性是其治疗的关键[4-5]。目前西医治疗药物主要以5-氨基水杨酸、糖皮质激素、生物制剂等为主[6]，疗效确切、起效快，但不良反应大、复发率高[7]。中药具有修复肠黏膜损伤等作用，可长期维持缓解、降低复发率，在防治UC方面具有独特优势[8-11]。前期临床实验[12-15]发现安肠愈疡汤具有健脾理气、化湿助运、清热解毒的作用。本研究在前期研究基础上，进一步从动物实验方面观察安肠愈疡汤对UC大鼠咬合蛋白（Occludin）、紧密连接蛋白 1（Claudin-1）及白细胞介素-13（IL-13）/酪氨酸激酶（JAK1）/信号转导与转录激活因子6（STAT6）信号通路的调控作用，探讨其修复肠黏膜屏障的机制，为中医药治疗UC提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 36只SPF级雄性SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，体质量（200±20）g，动物合格证号：SCXK（鲁）20190003，动物伦理审查批件号：AWE-2019-002。动物饲养于山东中医药大学附属医院动物实验中心，温度20～26℃，相对湿度40%～70%，12 h光照和12 h避光循环交替。

1.1.2 实验药品 安肠愈疡汤是山东省名中医迟莉丽教授自拟方，药物组成：生黄芪30g，败酱草30g，黄连 9g，黄芩 9g，炒白术 30g，薏苡仁 30g，木香 9g，槟榔 15 g，地榆炭 15 g，白及 15 g，当归 9 g，炒白芍12 g，防风6 g，生甘草9 g。药材购于山东中医药大学附属医院中药房，并在本院制剂室浸泡、煎煮、过滤、浓缩，按照所需配成高、中、低浓度药液，生药含量为分别为 0．375、0．75、1．5 g/mL，置于 4 ℃冰箱保存。美沙拉嗪缓释颗粒（法国Ethypharm公司，批号：190108）。

1.1.3 主要试剂和仪器 葡聚糖硫酸钠（DSS，MW36000-50000）（美国 MP Biomedicals公司，批号：0216011080）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120）；兔多克隆IL-13抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0560R）；兔单克隆STAT6抗体、JAK1抗体（英国Abcam 公司，批号：ab217998、ab133666）；兔单克隆Occludin抗体、Claudin-1抗体（英国Abcam公司，批号：ab167161、ab180158）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：Cat．#ZB-2301）；Claudin-1、Occludin、JAK1、STAT6、IL-13、PCR引物均由宝日医生物技术（北京）有限公司设计合成。全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；冷冻高速离心机（美国Thermo Scientific公司）；RT-6000自动酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；FluorChem Q蛋白印迹成像和定量分析系统（美国Proteinsimple公司）；电泳、电转系统（美国BIO-RAD公司）；PCR仪（德国Roche公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 建模及分组给药 大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法随机分为6组：空白组（6只），模型组（6只），中药低、中、高剂量组（各6只，简称低、中、高剂量组）和美沙拉嗪对照组（6只）。除空白组外，其余各组均连续7 d自由饮用4．5%DSS溶液，并于饮用DSS溶液第2天开始进行药物灌胃，依据《实验动物和动物实验技术》动物给药量计算，根据大鼠与人的体表面积等效剂量比值进行折算，中药低、中、高剂量组分别给予含生药为 0．375、0．75、1．5 g/mL的中药灌胃，美沙拉嗪对照组以0．035 g/mL的美沙拉嗪混悬液灌胃，空白组、模型组均以去离子水灌胃，以上各组均每次2 mL，每日1次，连续2周。

1.2.2 标本的采集与处理 干预结束后，将大鼠麻醉后取距肛门1 cm以上的结肠组织，冲洗干净后，肉眼观察炎症、溃疡情况，取病变最明显的组织，一部分结肠组织固定、包埋、切片后，HE染色，由2名经验丰富的病理科医师显微镜下观察，并参照文献[16]进行组织病理学评分。另一部分结肠组织于-80℃冰箱冻存，分别用于Occludin、Claudin-1蛋白、基因表达及IL-13、JAK1、STAT6的基因表达。

1.2.3 Western Blot法检测 Occludin、Claudin-1 蛋白的表达 先于液氮中研磨、裂解结肠组织，离心收集上清液，提取总蛋白，采用蛋白浓度测定（BCA）测定其浓度。取含有40 μg的蛋白溶液为上样量，经电泳、转膜、封闭后，分别加入结合一抗、二抗，再分别洗膜后，避光显色2 min，再置于全自动化学发光图像分析系统中进行扫描。量化标准为目标蛋白灰度值与标准蛋白灰度值的比。

1.2.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测结肠组织 Occludin、Claudin-1、IL-13、JAK1、STAT6 的表达 参照RNAiso Plus说明书采用RNAiso Plus提取总RNA，逆转录为cDNA、荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR反应，以GADPH为内参，2-ΔΔCt法计算，引物序列见表1。扩增引物见表1。

表1 目的基因与内参基因引物序列信息表Tab.1 Primer sequence information of target genes and internal reference genes

1.3 相关性分析 除空白组外，将各组中检测的Occludin和Claudin-1基因表达量逐一与 JAK1、STAT6、IL-13的基因表达量使用Spearman相关分析，计算出相关系数（γ），测定P值，从而分析各指标之间的相关性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 24．0统计软件，计量资料用均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。相关性分析采用Pearson线性相关，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠结肠组织病理学变化

2.1.1 病理学观察结果 模型组结肠组织结构不完整，局部可见隐窝消失及隐窝炎，大量淋巴浆细胞浸润，炎症累及黏膜下层。空白组结肠组织结构完整，隐窝结构存在，密集排列，固有层少量淋巴浆细胞浸润。低剂量组结肠组织结构较模型组好转，隐窝结构轻度改建，固有层大量炎性细胞浸润。高剂量组、美沙拉嗪组结肠组织趋于正常，隐窝结构改建，少量炎细胞浸润。中剂量组结肠组织病理变化程度介于低剂量组和高剂量组之间。见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理改变（HE，×200）Fig.1 Pathological changes of colon tissue in rats of each group(HE，×200)

2.1.2 病理学评分结果 与空白组比较，模型组结肠组织病理学（HPS）评分升高（P＜0．01）；与模型组比较，各用药组 HPS 评分均下降（P＜0．01），其中高剂量组低于低、中剂量组（P＜0．01 或 P＜0．05），差异均具有统计学意义；高剂量组与美沙拉嗪组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表2。

表2 各组大鼠结肠黏膜组织病理学评分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

表2 各组大鼠结肠黏膜组织病理学评分（±s）Tab.2 Colon mucosal histopathology score of rats in each group（±s） 分

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，##P＜0．01；与美沙拉嗪组比较，△△P＜0．01。

组别 动物数 HPS评分空白组 6 2．50±2．07模型组 6 15．33±1．51**低剂量组 6 9．50±2．51##△△中剂量组 6 5．33±1．16##△△高剂量组 6 1．83±1．60##美沙拉嗪组 6 2．83±1．17##

2.2 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1的蛋白及基因相对表达水平比较

2.2.1 Occludin、Claudin-1的蛋白表达 1）Occludin表达：模型组较空白组明显下调（P＜0．01），各用药组较模型组均明显上调（P＜0．01）；美沙拉嗪组不同程度优于低、中剂量组（P＜0．01 或 P＜0．05），差异均具有统计学意义。与高剂量组差异无统计学意义（P＞0．05）。2）Claudin-1 表达：模型组较空白组下调（P＜0．01），各用药组较模型组均上调（P＜0．01），美沙拉嗪组优于低、中剂量组（P＜0．01），差异均具有统计学意义。与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表3、图2。

表3 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1蛋白表达（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

表3 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1蛋白表达（±s）Tab.3 Expression of Occludin and Claudin-1 protein in rat colon of each group（±s）

注：与空白组比较，**P＜0．01；与模型组比较，##P＜0．01；与美沙拉嗪组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。

组别 动物数 Occludin Claudin-1空白组 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型组 6 0．45±0．12** 0．66±0．03**低剂量组 6 0．71±0．13##△△ 0．83±0．02##△△中剂量组 6 0．96±0．12##△ 0．98±0．04##△△高剂量组 6 1．05±0．14## 1．25±0．13##美沙拉嗪组 6 1．11±0．03## 1．42±0．20##

图2 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1蛋白变化Fig.2 Changes of Occludin and Claudin-1 protein in colonic tissues of rats in each group

2.2.2 Occludin、Claudin-1的基因表达 1）Occludin基因表达：模型组较空白组下调（P＜0．05），各用药组较模型组均上调（P＜0．01），美沙拉嗪组不同程度优于低、中剂量治疗组（P＜0．01 或 P＜0．05），差异均具有统计学意义。与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。2）Claudin-1 基因表达：模型组较空白组下调（P＜0．01），各用药组较模型组均上调（P＜0．01），美沙拉嗪组优于低、中剂量组（P＜0．01），差异均具有统计学意义。与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表4。

表4 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1基因表达（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

表4 各组大鼠结肠组织Occludin、Claudin-1基因表达（±s）Tab.4 Expression of Occludin，Claudin-1 gene in colon of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0．05，**P＜0．01；与模型组比较，##P＜0．01；与美沙拉嗪组比较，△P＜0．05，△△P＜0．01。

组别 动物数 0ccludin Claudin-1空白组 6 1．00±0．00 1．00±0．00模型组 6 0．60±0．10* 0．58±0．08**低剂量组 6 0．79±0．15##△△ 0．84±0．15##△△中剂量组 6 1．02±0．18##△ 1．01±0．15##△△高剂量组 6 1．18±0．21## 1．31±0．22##美沙拉嗪组 6 1．30±0．20## 1．51±0．21##

2.3 各组大鼠结肠组织IL-13、JAK1、STAT6基因转录水平变化

2.3.1 IL-13基因表达 模型组较空白组下调（P＜0．01），中、高剂量组及美沙拉嗪组较模型组均上调（P＜0．01），差异具有统计学意义；低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；美沙拉嗪组优于中、低剂量组（P＜0．01），差异具有统计学意义。与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见图3。

图3 各组大鼠结肠组织IL-13基因变化Fig.3 Changes of IL-13 gene in colon tissue of rats in each group

2.3.2 JAK1基因表达 模型组与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0．01），中、高剂量组及美沙拉嗪组较模型组均不同程度下调，差异具有统计学意义（P＜0．05 或 P＜0．01），低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；美沙拉嗪组优于低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0．05），与高剂量组、中剂量组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。见图4。

图4 各组大鼠结肠组织JAK1基因变化Fig.4 Changes of JAK1 gene in colonic tissues of rats in each group

2.3.3 STAT6基因表达 模型组与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0．01），各用药组与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）；美沙拉嗪优于低、中剂量组，差异具有统计学意义（P＜0．01），与高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0．05），见图5。

图5 各组大鼠结肠组织STAT6基因变化Fig.5 Changes of STAT6 gene in colon tissue of rats in each group

2.4 相关性分析结果 对Occludin和Claudin-1基因表达量逐一与JAK1、STAT6、IL-13的基因表达量使用Spearman相关分析，结果发现，Occludin和Claudin-1与 JAK1、STAT6表达水平呈负相关，Occludin和Claudin-1与IL-13表达水平呈正相关，Occludin、Claudin-1 与 JAK1、STAT6、IL-13 的基因表达量具有相关性，具体数值见表5。

表5 Occludin、Claudin-1 与 JAK1、STAT6、IL-13的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of Occludin，Claudin-1 and JAK1，STAT6，IL-13

3 讨论

UC的治疗目标逐渐由诱导并维持临床缓解、黏膜愈合、防治并发症转变为快速诱导缓解、长期维持缓解、完全的黏膜愈合等[17]。最近更提出了深度缓解和达标治疗的新策略[18-20]，即经过治疗后，达到和缓解，这是治疗UC的终极目标。因此治疗的关键是修复受损的肠黏膜屏障。Claudin-1蛋白作为肠黏膜机械屏障中紧密连接蛋白Claudins家族的一员，主要维护肠黏膜机械屏障的完整性和通透性[21]。Occludin蛋白是紧密连接中最重要的结构蛋白，参与紧密连接形成的信号调节[22-23]，研究表明，Occludin、Claudin-1表达下调，肠道通透性增加，导致肠腔内的细菌、抗原物质移位激活免疫细胞反应，是UC发生的重要机制之一[24]。因此，上调Occludin、Claudin-1表达水平可以修复肠黏膜屏障，可能是治疗UC的重要靶点。

近年来研究发现[25]，针对JAK/STAT通路的靶向治疗是修复肠黏膜屏障功能的重要突破点。STAT家庭共有7个成员，其中STAT6被证明在UC发病过程中可能发挥着重要的负性调节作用[26-28]。研究表明[29-30]，IL-13主要的信号通路为JAK/STAT途径，在UC中，抗炎细胞因子IL-13与IL-13RA结合，通过JAK/STAT途径，磷酸化STAT6，启动转录以调节免疫应答反应，参与肠上皮细胞的紧密连接、抗凋亡和黏膜修复过程。所以，通过激活IL-13/JAK/STAT6信号通路，加速肠道屏障功能的修复，是治疗UC的核心环节。

Kim等[31]研究发现：细胞模型实验中STAT3核转位增多，Occludin等多种肠屏障结构的蛋白基因表达降低。卫江鹏等[32]研究亦显示，UC患者肠黏膜Occludin和Claudin-1蛋白表达低于正常肠黏膜，而STAT3蛋白高于正常肠黏膜，两者间呈负相关，且病情越严重，相关性越明显。本研究结果也显示，安肠愈疡汤各用药组Occludin、Claudin-1基因、蛋白表达水平较模型组均不同程度上调，且高剂量组效果较好。除低剂量组外其余用药组不同程度激活IL-13/JAK1/STAT6通路的基因表达，高剂量组、美沙拉嗪组效果最好。Occludin和Claudin-1与JAK1、STAT6表达水平呈负相关，与IL-13表达水平呈正相关，提示Occludin、Claudin-1基因表达可能与IL-13/JAK/STAT信号通路有相关性，中药安肠愈疡汤可能通过激活IL-13/JAK1/STAT6信号通路，上调Occludin和Claudin-1的表达水平，促进UC大鼠肠黏膜修复。通过激活IL-13/JAK1/STAT6信号转导通路修复肠黏膜屏障，可能是治疗UC的一个新靶点。